Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

Durante las infecciones virales persistentes, las células T específicas de virus adquieren defectos funcionales en un proceso conocido como agotamiento de células T. A principios de los estudios in vivo en el modelo murino de LCMV infección viral crónica indican que las células T específicas del virus agotados han reducido la función citolítica contra las células infectadas por virus, pierden su capacidad de proliferar y han reducido la capacidad de producir citocinas como la IL-2, TNF- α e IFN-γ ^1,2. Una compleja red de vías inmunorreguladoras, tal como Pd-1 e IL-10, se regula positivamente durante las infecciones crónicas y contribuir a la disfunción de células T (revisado en ^3,4). La administración in vivo de anticuerpos de bloqueo contra estos vías inhibitorias en el ratón de LCMV modelo de la función de las células T específicas del virus agotadas y la eliminación del virus mejorada restaurado, lo que indica que el agotamiento de las células T es un fenómeno parcialmente reversible (revisado en ^5).

Los hallazgos en thmodelo de LCMV correo se extendió rápidamente a las infecciones virales crónicas humanas tales como el VHB, el VHC y el VIH ^5. En crónica por el VIH-1 infección, PD-1 e IL-10 vías están regulados por incremento en los sujetos infectados y se correlacionan con parámetros de progresión de la enfermedad, directamente con la carga viral e inversamente con el recuento de CD4 ^6-8. Bloqueo de anticuerpos de la PD-1 o IL-10 en la proliferación in vitro vías restaurado de las células específicas del VIH T CD4 y CD8 que indican que, similar al modelo de LCMV ratón, agotamiento de células T en los seres humanos es un fenómeno parcialmente reversible. Sin embargo, debido a la delicada naturaleza de los experimentos sobre muestras humanas, así como limitaciones en la sensibilidad de los ensayos in vitro, la investigación a fondo de los perfiles de restauración funcionales conseguidos por estas intervenciones es sorprendentemente ausente. Los ensayos de proliferación han sido, hasta ahora, el único ensayo fiable in vitro probado en la mayoría de los estudios, sin embargo, hay una notable falta de evidencia sobre el impacto de estos interintervenciones en: 1) la capacidad de destrucción de células T citotóxicas, 2) el efecto antiviral de células T en la replicación viral, 3) el perfil de secreción de citoquina, y 4) el efecto de la ayuda de células T CD4 en otros subgrupos de células.

Tinción intracelular de citoquinas (ICS) es una herramienta muy útil y ampliamente utilizado ensayo basado en citometría de flujo que se utiliza para detectar la producción de citoquinas en diversos tipos de células en ratones y seres humanos. También se ha utilizado para investigar el efecto de bloqueo de anticuerpos de las vías inhibitorias. En los ensayos de partida de la ICS, la secreción de citoquinas es bloqueado por la adición de Brefeldina y / o monensina. Las citoquinas atrapados dentro de las células se detectaron con anticuerpos fluorescentes utilizando citometría de flujo policromática. La duración del ensayo se limita generalmente a 6 o 12 h después de la estimulación antigénica, ya que ambos Brefeldina y monensina, que se añaden típicamente dentro de 2 h de la adición de antígeno, son tóxicos para las células. El ensayo ICS es una poderosa técnica que ha sido i útiln la investigación del efecto de la administración in vivo de bloqueo de la intervención de anticuerpos en ratones en los que se extraen las células después de un cierto período de tiempo después de la exposición anticuerpo ^9. Sin embargo, hay varias limitaciones para la aplicación de este enfoque experimental para evaluar el impacto de bloqueo de los receptores inhibitorios en muestras humanas. Al realizar intervenciones de anticuerpos de las vías inhibitorias en una hora estimulación 6 o 12 in vitro (normalmente el caso con muestras humanas), bloqueo de los receptores inhibitorios en la mayoría de los casos no altera la frecuencia de responder las células T específicas de antígeno tal como se mide mediante ensayos estándar de ICS ^{6, 7.} Las mediciones de la producción de citoquinas por células, medida por la intensidad media o la mediana de la fluorescencia han dado resultados inconsistentes ^{6, 7, 10.} Por otro lado, cuando ICS se realiza en un punto de tiempo finales después de la estimulación (es decir, seis días), los cambios en el número de citoquinas que secretan Cells se pueden observar. Las diferencias son un efecto combinado de la proliferación alterada, la supervivencia, y los cambios en la función efectora que se acumulan durante el período de tiempo especificado ^6. Una forma de superar parcialmente estas limitaciones es incubar durante largos periodos de tiempo (por ejemplo, 36 h, 60 h, etc.) Con el antígeno antes de la adición del bloqueante de la secreción de citoquinas, sin esperar a que se produzca la proliferación. Hemos utilizado con éxito este método para determinar la cinética de la secreción de citoquinas por las células específicas del VIH T CD4 y CD8 ^11,12; sin embargo, este enfoque no es capaz de detectar pequeñas respuestas y no dará un resultado integrado de la secreción total de citoquinas que ocurre ya que la estimulación. Por lo tanto, ICS no es un método lo suficientemente sensible para detectar el impacto de bloqueo de las vías inhibitorias de la cantidad de citocinas producidas por las células T activadas en comparación con mRNA de citoquinas cuantificación o mediciones de la secreción de citoquinas en el supernatant en los mismos puntos de tiempo. Además, la mayoría de las citoquinas producidas por las células T activadas actúan en forma autocrina por contribuir a la retroalimentación positiva o negativa bucles a través de la interacción con las células presentadoras de antígeno. Por lo tanto, la adición de Brefeldina o monensina durante el ensayo ICS impide la secreción de citoquinas y por lo tanto la estimulación de las células T no es óptima. Finalmente, la detección de múltiples citoquinas con ICS está limitado por la disponibilidad y la sensibilidad de los anticuerpos para la detección de citoquinas con citometría de flujo, así como por las limitaciones en el número de fluorocromos que pueden ser utilizados simultáneamente en cualquier panel dado.

Desarrollamos un método de alta sensibilidad in vitro experimental para evaluar el impacto de las vías inmunorreguladoras en la regulación de la secreción de citocinas por las células específicas del VIH T CD4 y posteriormente ayuda CD4 a células presentadoras de antígenos (CPA) y las células asesinas naturales (células NK). Este método también se puede utilizar para evaluar la IMPAct del bloqueo de las moléculas inhibidoras sobre la función de las células T CD8 de ozono las células T CD4 de PBMCs o mediante la estimulación con péptidos óptimos que son reconocidos sólo por las células T CD8. En contraste con los ensayos de tinción intracelular de citoquinas, hemos decidido no interferir con la secreción de citoquinas por las células-T CD4 específicas del VIH con el fin de ser capaz de: 1) realizar una cuantificación más precisa de los niveles de citoquinas producidas; 2) investigar un panel más amplio de citocinas o moléculas efectoras, y 3) evaluar el impacto de las citoquinas producidas por las células específicas del VIH CD4 T en otros subconjuntos de células. Estimulamos CD8 PBMC empobrecido con un VIH-1 Gag péptido piscina en la presencia de anticuerpos de bloqueo para la vía inmunorreguladora de interés. Después del tiempo deseado de incubación, por lo general 48 horas, recogemos los sobrenadantes para medir la secreción de citoquinas con matrices de perlas y recoger los gránulos de las células, ya sea para el análisis fenotípico de los diferentes subconjuntos de células o para el análisis de la transcripción. Es de destacar que en tsu punto de tiempo 48 horas, no se detecta una población significativa de la proliferación de las células T ^12. Este es un enfoque flexible y varias adaptaciones de este diseño se puede aplicar para hacer frente a diferentes hipótesis. Por ejemplo, los subconjuntos de células individuales (tales como las células-T CD4 específicas del VIH o de PD-1 de células de alta T CD4, etc.) Se pueden ordenar después de 12 horas de incubación antes de una incubación adicional durante 36 horas seguido por la recolección de los sobrenadantes y sedimentos celulares para investigar más específicamente el impacto de las intervenciones del bloqueo sobre la secreción de citoquinas por las subpoblaciones definidas de PBMCs.