In vitro per valutare l'impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

Durante le infezioni virali persistenti, specifiche cellule-T virus acquisiscono difetti funzionali in un processo noto come l'esaurimento delle cellule T. All'inizio studi in vivo nel modello murino LCMV di infezione virale cronica indicato che le cellule T virus-specifici esauste una riduzione della funzione citolitica contro cellule infettate da virus, perdono la loro capacità di proliferare e una capacità ridotta di produrre citochine come IL-2, TNF- α e IFN-γ ^1,2. Complessa rete di percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated durante le infezioni croniche e contribuire alla disfunzione delle cellule T (recensito in ^3,4). Nella somministrazione in vivo di bloccare anticorpi contro queste vie inibitorie nel topo LCMV modello di funzione delle cellule T virus-specifici esaurite e la clearance virale maggiore restaurato, indicando che l'esaurimento delle cellule T è un fenomeno parzialmente reversibile (recensito in ^5).

Giudizio su °e modello LCMV sono stati rapidamente estesa a infezioni virali croniche umani quali HBV, HCV e HIV ^5. In cronica da HIV-1, PD-1 e IL-10 percorsi sono upregulated in soggetti infetti e correlano con parametri di progressione della malattia, direttamente con la carica virale e inversamente con la conta CD4 ^6-8. Anticorpo blocco dei PD-1 o IL-10 percorsi in vitro restaurato proliferazione di HIV-specifiche cellule T CD4 e CD8 indicano che, simile al modello di topo LCMV, esaurimento delle cellule T nell'uomo è un fenomeno parzialmente reversibile. Tuttavia, a causa della natura delicata di esperimenti su campioni umani nonché limitazioni nella sensibilità dei saggi in vitro, un'indagine approfondita dei profili ripristino funzionale ottenuti da questi interventi è sorprendentemente assente. Saggi di proliferazione sono stati, finora, l'unico test affidabile in vitro testato in maggior parte degli studi, ma vi è una notevole mancanza di prove sull'impatto di questi, tra l'interventi su: 1) la capacità di uccisione delle cellule T citotossiche, 2) l'effetto antivirale di cellule T sulla replicazione virale, 3) il profilo secrezione di citochine, e 4) l'effetto su aiuto delle cellule T CD4 su altri sottogruppi di cellule.

Intracellulare di citochine colorazione (ICS) è un flusso molto utile e ampiamente utilizzati saggio basato citometria che viene utilizzato per rilevare la produzione di citochine in vari tipi di cellule, sia nei topi e nell'uomo. E 'stato anche utilizzato per studiare l'effetto di anticorpi blocco di vie inibitorie. In saggi ICS, secrezione di citochine è bloccata con l'aggiunta di brefeldina e / o Monensina. Le citochine intrappolati all'interno delle cellule sono poi rilevate con anticorpi fluorescenti con citometria a flusso policromo. La durata del test è solitamente limitato a 6 o 12 ore dopo la stimolazione antigene poiché sia ​​brefeldina e monensina, che sono tipicamente aggiunti in 2 ore di antigene indicato, sono tossici per le cellule. Il saggio ICS è una potente tecnica che è stata i utilen l'indagine l'effetto della somministrazione in vivo di bloccare intervento anticorpo nei topi in cui le cellule sono state estratte dopo un certo periodo di tempo dopo l'esposizione anticorpo ^9. Tuttavia, vi sono diverse limitazioni per l'applicazione di questo approccio sperimentale per valutare l'impatto del blocco dei recettori inibitori in campioni umani. Durante l'esecuzione di interventi di anticorpi vie inibitorie in un hr stimolazione 6 o 12 in vitro (tipicamente il caso con campioni umani), il blocco dei recettori inibitori in molti casi non modifica la frequenza di rispondere cellule T antigene-specifiche come misurata mediante saggi circuiti integrati standard ^{6, 7.} Le misurazioni della produzione di citochine per cella misurati mediante media o la mediana intensità di fluorescenza hanno dato risultati inconsistenti ^{6, 7, 10.} D'altra parte, quando ICS viene eseguita in un punto temporale in ritardo dopo la stimolazione (ovvero sei giorni), le variazioni del numero di citochina-secernente cells possono essere osservati. Le differenze sono un effetto combinato della proliferazione alterata, sopravvivenza, e cambiamenti nella funzione effettrice che si accumulano durante il periodo di tempo specificato ^6. Un modo per superare in parte questi limiti è quello di incubare per lunghi periodi di tempo (ad esempio 36 hr, 60 hr, ecc.) Con l'antigene prima l'aggiunta del bloccante secrezione di citochine senza attendere la proliferazione si verifichi. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per determinare la cinetica di secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e CD8 ^11,12, tuttavia, questo approccio non è in grado di rilevare piccole risposte e non dia un risultato integrata della secrezione di citochine totale verificano poiché la stimolazione. Pertanto, ICS non è un metodo abbastanza sensibile per rilevare l'impatto del blocco di vie inibitorie sulla quantità di citochine prodotte dalle cellule T attivate rispetto a mRNA quantitativa o misure di secrezione di citochine nel supernatant agli stessi punti temporali. Inoltre, la maggior parte delle citochine prodotte dalle cellule T attivate agire in maniera autocrina contribuendo al feedback positivo o negativo passanti attraverso l'interazione con le cellule presentanti l'antigene. Pertanto, l'aggiunta di brefeldina o Monensina durante il saggio ICS impedisce la secrezione di citochine e quindi la stimolazione delle cellule T non è ottimale. Infine, il rilevamento di citochine multiple con ICS è limitata dalla disponibilità e sensibilità di anticorpi per il rilevamento di citochine mediante citometria a flusso, nonché da vincoli nel numero di fluorocromi che possono essere utilizzati contemporaneamente in un dato pannello.

Abbiamo sviluppato un approccio altamente sensibile in vitro sperimentale per valutare l'impatto delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e successivamente CD4 contribuiscono a cellule presentanti l'antigene (APC) e le cellule natural killer (cellule NK). Questo metodo può anche essere utilizzato per valutare l'impact del blocco di molecole inibitori sulla funzione delle cellule T CD8 mediante deplezione delle cellule T CD4 da PBMC o stimolando con peptidi ottimali che vengono riconosciuti solo dalle cellule T CD8. In contrasto intracellulari saggi citochina colorazione, abbiamo deciso di non interferire con la secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 per essere in grado di: 1) effettuare una quantificazione più accurata dei livelli di citochine prodotte; 2) indagare un pannello più ampio di citochine o molecole effettrici e 3) valutare l'impatto delle citochine prodotte da HIV-specifiche cellule T CD4 su altri sottoinsiemi di cellule. Stimoliamo CD8 PBMC impoverito a HIV-1 Gag piscina peptide in presenza di anticorpi bloccanti per la via immunoregolatorio di interesse. Dopo il tempo desiderato di incubazione, di solito 48 ore, raccogliamo il surnatante per misurare la secrezione di citochine con array di perline e raccogliere i pellet cellulari sia per l'analisi fenotipica delle diverse sottopopolazioni cellulari o per l'analisi trascrizionale. Da segnalare, al tempo til suo 48 punto di tempo hr, noi non rileva una significativa popolazione di cellule proliferanti T ^12. Questo è un approccio flessibile e diversi adattamenti di questo motivo può essere applicato per affrontare diverse ipotesi. Per esempio, i singoli sottogruppi di cellule (come HIV-specifiche cellule T CD4 o PD-1 le cellule T CD4 elevati, ecc.) Possono essere scelti dopo 12 ore di incubazione prima ulteriore incubazione per 36 ore seguita da collezione di supernatanti e pellet cellulari indagare più specificamente l'impatto degli interventi del blocco sulla secrezione di citochine da sottopopolazioni definite di PBMC.