פרוטוקול מובנה מוצג לassay מבוסס תאים כמבחן פונקציונלי לנבא את הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית באמצעות ספקטרוסקופיית סלולרית דיאלקטרי (CDS). Assay ניתן לבצע עם תאים טריים או קפוא היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) וההליך יושלם בתוך 4 ימים.
פרוטוקול זה מפרט את ההליך ניסיוני ואנליטיים לassay מבוסס תאים שפותח במעבדה שלנו כמבחן פונקציונלי לנבא את הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית בילדים אסימפטומטיים ומושפעים. Assay מורכב מההערכה של המצב התפקודי של חלבוני Gi ו-G בתאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) על ידי ספקטרוסקופיה הסלולרית דיאלקטרי (CDS), תוך שימוש במכשיר אוטומטי המבוסס על ה-CDS, וסיווגם של ילדים לשלוש קבוצות פונקציונליות (FG1 , FG2, FG3) ביחס לפרופיל של חוסר איזון בין מידת התגובה לGi וגירוי חלבוני GS. הסיווג הוא אושר עוד יותר על ידי אפקט ההפרש של osteopontin (OPN) בתגובה לגירוי Gi בין קבוצות ואת ההתקדמות החמורה של מחלה הפניה FG2. כ, בהיקף של 10 מיליליטר של דם נדרש כדי לחלץ PBMCs ידי Ficoll-שיפוע ותאים אז מאוחסן בחנקן נוזלי. המספר מספיק של PBMCs לבצע assay מתקבל לאחר יומיים של תרבית תאים. בעיקרו של דבר, תאים מודגרת ראשון עם phytohemmaglutinin (PHA). לאחר 24 דגירה שעות, בינוני הוא הוחלף על ידי תרבות בינונית ללא PHA ל24 שעות נוספות לפני זריעת תאים וטיפול OPN. לאחר מכן תאים מוקרנים spectroscopically לתגובות שלהם לסומטוסטטין וisoproterenol, אשר בהתאמה להפעיל חלבוני Gi וGs באמצעות קולטנים מאותו המקור שלהם. סומטוסטטין וisoproterenol שניהם הזריקו בו זמנית עם מערכת fluidics משולבת והתגובות של התאים נמצאות תחת פיקוח במשך 15 דקות. Assay ניתן לבצע עם PBMCs טריות או קפוא וההליך יושלם בתוך 4 ימים.
עקמת אידיופטית היא עיוות בעמוד השדרה של גורמים לא ידועים בדרך כלל מוגדרת כעקמומיות לרוחב גדולה יותר מ10 מעלות מלוות בסיבוב בחוליות 1. המצב משפיע על 4% מאוכלוסיית הילדים, והוא בדרך כלל מאובחן בגילאי 9 עד 13 2,3,4. האבחנה היא בעיקר של הדרה ונעשתה רק לאחר שלילת גורמים אחרים של עיוות בעמוד השדרה, כגון מום בעמוד השדרה, התוקפת או הפרעות syndromic. באופן מסורתי, הסימטריה trunkal מתגלה על ידי מבחן קדימה כיפוף אדמס ונמדדה עם scoliometer במהלך בדיקה גופנית 5. האבחון ואז יכול להיות מאושר על ידי תצפית רדיוגרפי של העקומה ומדידת הזווית תוך שימוש בשיטת קוב 6.
לאחר שאובחן, הדאגה העיקרית עבור רופאים בניהול ילדי scoliotic היא האם העקומה תהיה התקדמות. ואכן, את ההתקדמות העקומה היא לעתים קרובות בלתי צפויה והוא נצפה בקרב בנות בתדירות גבוהה יותר מאשר אצל בני 7. אם לא מטפלים, העקומה יכולה להתקדם באופן דרמטי, ויוצרת עיוות פיזית משמעותית ובעיות אפילו cardiopulmonary. גילויים אלה הופכים סכנת חיים כאשר העקומה עולה 70 ° 8,9. אפשרויות הטיפול הנוכחיות כדי למנוע או לעצור את ההתקדמות עקומה כוללות מרעננות וניתוח. באופן כללי, המרענן מומלץ לעקומות בין 25-40 °, ואילו ניתוח שמור לעקומות גדולות מ45 ° או להגיב למרענן.
כ, 10% מילדים שאובחנו עם עקמת אידיופטית יש התקדמות עקומה הדורשת ניתוח מתקן 10. נכון לעכשיו, לא קיימת שיטה או בדיקה זמינה לזהות קטגוריה זו של חולים מוכחים. כתוצאה מכך, כל הילדים שאובחנו חשופים לצילומי רנטגן המרובים על פני מספר שנים, בדרך כלל עד שהם מגיעים לבגרות שלד. הערכה היא כי החולים הטיפוסיים עם עקמת יהיו ליכ 22 בדיקות רדיולוגיות על פני תקופה של 3 שנות 11. בגלל הסיכון הפוטנציאלי של בדיקות רדיוגרפי מרובות, הגישות חלופיות, שעלול לאפשר ביצוע הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית בלי לחשוף ילדים לקרינה מייננת הן מאוד רצויות. במטרה לענות על צורך זה, פיתחנו בעבר assay הקרנה מבוסס תאים כמבחן פרוגנוסטיים לזהות מוקדם את הילדים אסימפטומטיים בסיכון לפתח עקמת אידיופטית. המבחן מנבא את התוצאה הקלינית בשני ילדים אסימפטומטיים ומושפעים על ידי בחינת המצב התפקודי של חלבוני Gi וסיווג ילדים לשלוש קבוצות פונקציונליות (FG1, FG2 וFG3) בהתאם למידת תגובה לגירוי מקסימלי חלבון Gi 12 כפי שהיא נמדדת על ידי CDS מערכת מבוססת. מערכת זו משמשת בעיקר כדי להעריך את העברת אותות באמצעות חלבוני G בסוגי תאים שונים 13,14,15,16. זה מניב מידע לגבי תגובה כוללת משולבת של התאים לגירויים החיצוניים על ידי מדידת שינויים בעכבה בעקבות ההפעלה של הקולטנים בתא שטח. תאים הם זורעים לתוך microplates המכילים אלקטרודות בתחתית הבארות והמערכת חלה מתח קטן שיוצר זרמים תאיים וtranscellular. לאחר הזרקת תרכובת לתוך הבאר, קולטני תא שטח הם גירוי ואירועים הולכים אותות להתרחש, מה שמוביל לשינויים תאיים המשפיעים על הזרימה של זרמים תאיים וtranscellular, ובכך להשפיע על הגודל הנמדד. עם גישה זו, חולי scoliotic וילדים בסיכון גבוהים יותר לפתח עקמת מגיבים פחות לגירוי חלבון Gi בהשוואה לנבדקים בריאים, והסיווג מבוסס על אחוז ממידת הפחתה ביחס לקבוצת ביקורת. טווחי הסיווג קבועים בין 10 40% לFG3, 40 ו60% לFG2, ו60 ו90% לFG1 12.
<p class = "jove_content"> לאחרונה, יש לנו שונה בגישה זו על ידי הוכחת כי באופן ברור ניתן להבחין בשלוש הקבוצות פונקציונליות בהתאם לפרופיל של חוסר איזון בין התגובה לGi וגירוי GS. ואכן, מצאה שתגובה לגירוי Gi שלטה בFG3, בעוד שאין חוסר איזון לכאורה נצפה בFG2. לעומת זאת, FG1 הציג דומיננטיות לתגובה לגירוי GS. בנוסף, יש לנו סיפקנו את הראיות לכך שחולים השייכים לFG2 נמצאים בסיכון גבוה יותר של התקדמות עד לנקודה של צורך ניתוח 17. הדיוק של בדיקת סיווג זה עוד יותר שופר על ידי הוכחת השפעת ההפרש של osteopontin (OPN) בתגובה לגירוי Gi בין קבוצות פונקציונליות.כאן אנו לתעד את הצעדים מפורטים של הפרוצדורות ואנליטי של בדיקה פונקציונלית זו הופיעה ככרגע במעבדה שלנו.
יש לנו תארנו הליך מפורט של בדיקה מבוססת תאים פרוגנוסטיים לעקמת אידיופטית כי הוא ישים לתאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) מבודדת טרי או קפוא נשמרת לתקופה של שנה עד אחד בחנקן נוזלי. מאז באמצעות PBMCs מבודדת טרי הוא מסורבל כאשר בודקים מספר גדול של אנשים, ההליך הוצג עם PBMCs הקפואה המציעות חלופה מעשית יותר בהגדרה קלינית. עם זאת, בעיות עם התא clumping על הפשרה היו נתקלו בעת PBMCs הקפואה היו בתחילה בשימוש, מה שמובילה לעתים לשונות בין assay. על מנת למקסם את שחזור assay, אנו ממליצים להימנע ממחזור ההפשרה הקפאה ושימוש במדגם הקפוא רק פעם אחת. ההליך הוא פשוט מאוד, המאפשר זיהוי מדויק של תפקוד חלבון Gi הפגום בזמן קצר. באמצעות הליך זה, ניתן לסווג ילדים אסימפטומטיים וscoliotic קלות לנבא התוצאה הקלינית שלהם טובים יותר ללא סכנה כלשהי לבריאותם. הוwever, בעת ביצוע סיווג על פי מידת התגובה המרבית לGi גירוי ביחס לנבדקים בריאים 12, כמה דרישות לנבדקי ביקורת צריכה להיות נפגשו. ואכן, כדי שתהיה לי עוקבה השוואה ראויה, נושאי השליטה חייבים להיות גיל ומין מתאים, לא יהיו על כל סוג של טיפול תרופתי, ולספק מידע אישי, כגון היסטוריה בעבר בודדת / משפחתית רפואית. דרישות אלה עלולות להוות מכשול חשוב לגיוס של נבדקי ביקורת. לכן, ביצוע סיווג על ידי בחינת המידה של חוסר איזון בין התגובה לגירוי חלבון Gi ו-G באותו האדם הוא אידיאלי כדי לחסל את הצורך בשימוש בקבוצת בקרה.
השימוש במערכת מבוססת CDS לבצע בדיקה פרוגנוסטיים זה הוא משמעותי במונחים של בו זמנית לספק Gi-ותגובות הסלולר בתיווך-GS באותו assay. למרות שניתן לסווג חולים רבים ללא ambiguity באמצעות הטווח הדינמי קבוע עבור assay זה, מספר קטן של חולים יפגין ערכים בגבול של טווחים, כפי שמדגים את התוצאות של הדו"ח הנוכחי. להפלות אנשים אלה, יש לנו הציגו ההערכה של ההשפעה של OPN בתגובה לגירוי Gi ידי הוכחת כי OPN גורם השפעת ההפרש על תגובה תאית בתיווך-Gi בין שלוש הקבוצות פונקציונליות. ואכן, מצאנו כי בנוכחותו של OPN, בתגובה לעליות גירוי Gi בFG1, תוך שהוא מקטין בFG2 וFG3, בFG2 מידה גבוהה יותר. למרות העלות הגבוהה של OPN, שימוש הכמוקין חיוני להבחין מקרים מעורפלים, ולכן לשפר את הדיוק של assay הסיווג שלנו. עם זאת, יש assay זה חסרון שבמינימום של 1.5 x 10 5 תאים לכל גם נדרש להתבונן תגובה תאית עם המערכת מבוססת ה-CDS בתנאי הניסוי שלנו. דגימות מטופל מסוימות לא תהיה לי מספר מספיק שלתאים להיבדק. במקרה זה, יש צורך לזכור את החולים עבור איסוף דם נוסף, שיכול להיות מדאיג עבור משפחות ומתסכלות עבור צוות הרפואי ומעבדה. מחקרים פרוספקטיביים מתוכננים במעבדה שלנו כדי לטפל בבעיה זו.
עם זאת, הפרוטוקול הנוכחי מסתמך על שיטות פשוטות ומוכחות להכנת תאים ואילו הבדיקות מתבצעות באופן אוטומטי באמצעות מערכת תוקף ללא תווית 13, 14 לעקוב אחר תגובותיהם של התאים. פלטפורמת הבדיקות היא זולה יחסית בהשוואה לפלטפורמה גנטית זמינה עבור הפרוגנוזה של מחלות אחרות. כמו כן, העלות של כל החומרים חד פעמים, כוללים צינורות איסוף דם, טיפים, האלקטרודה המיוחדת microplates, וחרוטים וצינורות Eppendorf, היא לא יקרה מאוד ונאמדה בפחות מ -3,000 דולרים כדי להשלים בדיקות לכאלף חולים. למרות הערכה זו אינה כוללת את עלויות עבודה להכנת דגימותומבצע את הבדיקה, בדיקה זו נשארה הרבה יותר זול מאשר פלטפורמות הדור הבא של רצף. ראויים לציון, הוא השוואת העלות לא רק לפלטפורמות גנטיות, אבל באופן ספציפי יותר הקשורים לתחום של AIS, הוא העלויות הכרוכות להדמיה רדיולוגית. היום, יותר ממיליון ילדים בארה"ב וכ -100,000 ילדים בקנדה מאובחנים עם עקמת אידיופטית, והעלות הכוללת של אבחון וניטור של ילדי scoliotic ידי חשיפת רנטגן היא מעל 2.5 מליארד דולרים בשנה בצפון אמריקה. לפיכך, הליך assay מבוסס התאים שלנו יהיה צפוי להיות מתאים להקרנה ומעקב אחר ילדים עם עקמת אידיופטית ללא סיכון בריאותי ובעלות נמוכה יותר שיגרתי.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ La Fondation איב Cotrel de l'Institut de France, פריז, צרפת (לד"ר מורו), המכון הקנדי לחקר בריאות (מענק PP2-99,466 לד"ר מורו) ומהממד הרביעי השדרה LLC , ניו יורק, ארה"ב (מענק מחקר לד"ר מורו).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |