Bir yapılandırılmış protokol hücresel dielektrik spektroskopi (CDS) kullanarak idiopatik skolyoz prognozu tahmin etmek için bir fonksiyonel test olarak bir hücre bazlı deney için sunulmuştur. Deney, taze ya da dondurulmuş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ile yapılabilir ve prosedür 4 gün içinde tamamlanır.
Bu protokol asemptomatik ve etkilenen çocuklarda idiopatik skolyoz prognozu tahmin etmek için fonksiyonel bir test olarak laboratuvarda geliştirilen bir hücre bazlı tahlil için deneysel ve analitik yordamı ayrıntıları. Deney üç fonksiyonel grup (FG1 içine bir otomatik CDS tabanlı alet, ve çocukların sınıflandırması kullanılarak, hücresel dielektrik spektroskopisi (CDS) periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) in Gi ve Gs proteinlerinin fonksiyonel durumunun değerlendirilmesi oluşmaktadır Gi ve Gs proteinleri uyarılmaya yanıt derecesi arasında dengesizlik profili ile ilgili olarak, FG2, FG3). Sınıflandırma ayrıca grupları ve hastalığın ciddi bir ilerleme FG2 tarafından başvurulan arasında Gi uyarılmasına yanıt osteopontin (OPN) ayırıcı etkisi ile teyit edilir. Yaklaşık olarak, kanın 10 ml 'lik bir hacim Ficoll-gradyanı sağlamakta ve hücreler tarafından PBMC elde etmek için gerekli olan daha sonra sıvı azot içinde saklanır. P yeterli sayıdaBMCS deneyi gerçekleştirmek için hücre kültür iki gün sonra elde edilir. Esasen, hücreler önce phytohemmaglutinin (PHA) ile inkübe edilir. 24 Saat inkübe edildikten sonra, ortam önce hücre tohumlama ve OPN tedavisine ilave bir 24 saat boyunca bir PHA-içermeyen kültür ortamı ile değiştirilir. Hücreler daha sonra, spektroskopik olarak, sırasıyla, aynı kökenli reseptörleri aracılığıyla Gi ve Gs proteinleri aktive somatostatin, izoproterenole yanıtları için taranır. Somatostatin isoproterenol ve her ikisi de eş zamanlı olarak entegre bir akar bilimi sistemine enjekte edilir ve hücrelerin tepkileri, 15 dakika süre ile izlenir. Deney, taze ya da dondurulmuş PBMC ile yapılabilir ve prosedür 4 gün içinde tamamlanır.
İdiopatik skolyoz genellikle vertebra rotasyon 1 eşliğinde 10 dereceden daha büyük bir yanal eğrilik olarak tanımlanan nedeni bilinmeyen bir omurga deformitesi olduğunu. Durum pediatrik nüfusun% 4 etkiler ve en sık 9 ila 13 yaşındaki 2,3,4 yaşları arasında teşhis edilir. Tanı öncelikle dışlanmanın ve sadece bu vertebra malformasyon, nöromüsküler veya sendromik bozukluklar gibi omurga deformitesi diğer nedenleri ekarte edildikten sonra yapılır. Geleneksel olarak, trunkal asimetri Adams öne eğilme testi ile saptandı ve fiziksel muayene sırasında 5 scoliometer ile ölçülür. Tanı sonra radyografik eğrinin gözlenmesi ve Cobb yöntem 6 kullanılarak açı ölçümü ile teyit edilebilir.
Bir kez tanı, scoliotic çocukları yönetmek hekimler için birincil endişe eğrisi ilerleme olup olmadığıdır. Gerçekten de, eğri ilerleme genellikle önceden tahmin edilemez vedaha sık kızlar arasında görülen erkek 7 daha hızlıdır. Eğer tedavi edilmezse, eğri önemli fiziksel deformite ve hatta kardiyopulmoner sorunlar yaratarak, dramatik ilerleyebilir. Bu bulgular eğrisi 70 ° 8,9 aştığında hayatı tehdit haline gelir. Eğri ilerlemesini engellemek ya da durdurmak için mevcut tedavi seçenekleri canlandırıcı ve cerrahi içerir. Cerrahi eğrileri 45 ° den büyük ya da takviye yanıtsız için ayrılmış ise, genel olarak, takviye 25-40 ° arasında eğrileri için tavsiye edilir.
Yaklaşık olarak, idiopatik skolyoz tanısı alan çocukların% 10 düzeltici cerrahi gerektiren 10 eğri ilerlemesini var. Şu anda, hiçbir kanıtlanmış bir yöntem ya da bu hasta kategorisini tanımlamak için kullanılabilir bir test yoktur. Sonuç olarak, tüm teşhis çocuklar iskelet olgunluğuna ulaşmak genellikle kadar, birkaç yıl içinde birden fazla radyograma tabi tutulur. Skolyoz ile tipik hastalarda olacağı tahmin edilmektedir3 yıllık süre 11 yılı yaklaşık 22 radyolojik tetkikler. Çünkü çoklu radyografik incelemelerin potansiyel risk, iyonize radyasyona maruz kalmadan çocuklar idiopatik skolyoz prognozu performans izin verebilecek alternatif yaklaşımlar şiddetle arzu edilir. Bu ihtiyacı karşılamak amacıyla, daha önce er idiopatik skolyoz gelişme riski asemptomatik çocukların belirlenmesi için bir prognostik test olarak bir hücre tabanlı tarama tahlili geliştirdi. Test Gi proteinlerinin fonksiyonel durumunu inceleyerek ve CDS ile ölçülen Gi protein uyarım 12 maksimum yanıtın derecesine göre üç fonksiyonel gruplar (FG1, FG2 ve FG3) içine çocuk sınıflandırarak hem asemptomatik ve etkilenen çocuklarda klinik sonucunu tahmin tabanlı sistem. Bu sistem, çok çeşitli hücre tipleri 13,14,15,16 G proteinleri yoluyla sinyal iletimini değerlendirmek için kullanılır. Bu, ilgili bilgi verirhücre yüzeyi reseptörlerinin aktivasyonu empedansı aşağıdaki değişiklikleri ölçerek dış uyarılara karşı hücrelerin toplam entegre cevabı. Hücreler, kuyuların altındaki elektrotlar içerir ve sistem, hücre dışı ve hücre üzerinden akımlarını hasıl küçük bir gerilim uygular bu mikro içine tohumlanır. Kuyuya bileşiği enjeksiyonundan sonra, hücre yüzeyi reseptörleri uyarılır ve sinyal transdüksiyon etkinlikleri hücre dışı ve hücre üzerinden akım akışını etkileyen hücresel değişikliklere yol açan, ortaya çıkar ve bu şekilde ölçülen büyüklüğünü etkiler. Bu yaklaşımla, skolyoz gelişme riski scoliotic hastalar ve çocuklar daha sağlıklı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında Gi protein stimülasyon daha az duyarlı ve sınıflandırma kontrol grubuna göre azalma göreceli derecesi yüzde dayanmaktadır. Sınıflandırma aralıkları FG3, 40 ve FG2 için% 60 ve 60 ve FG1 12 için% 90 10 ve% 40 arasında sabitlenir.
<p class = "jove_content"> Daha yakın zamanlarda, biz üç fonksiyonel gruplar açıkça Gi ve Gs uyarılmasına tepki arasındaki dengesizlik profiline göre ayırt edilebilir olduğunu göstererek bu yaklaşımı değiştirdiniz. Gerçekten de, belirgin bir dengesizlik FG2 gözlenmiştir ise Gi uyarısına yanıt FG3 içinde hakim olduğu bulunmuştur. Bunun aksine, FG1 Gs uyarılmaya yanıt için baskın sergiledi. Buna ek olarak, biz FG2 ait hastalar ameliyat 17 ihtiyacı noktasına ilerliyor riski daha fazla olduğunu kanıtlar sağlamıştır. Bu sınıflandırma testin hassas başka fonksiyonel gruplar arasında Gi uyarılmasına yanıt osteopontin (OPN) bir diferansiyel etkisini gösteren ile iyileştirilmiştir.İşte biz şu anda bizim laboratuvarda yapılan bu fonksiyonel test deneysel ve analitik prosedürlerin ayrıntılı adımlar belgelemek.
Bu taze olarak izole edilen veya sıvı azot içinde bir yıla kadar donmuş halde muhafaza edilmiş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri için de geçerlidir idiyopatik skolyoz için hücre bazlı bir prognostik testi (PBMC) ayrıntılı bir prosedür tarif eder. Bireylerin büyük sayıda test ederken taze olarak izole edilen PBMC'ler kullanılarak ağır olduğu için, bu prosedür klinik ortamda daha pratik bir alternatif sunmaktadır dondurulmuş PBMC verildi. Dondurulmuş PBMCler başlangıçta arası tahlil değişkenliği bazen lider, kullanılan Ancak, çözüldükten sonra hücre topaklanma ile karşılaşılan sorunları. Tahlil tekrarlanabilirliğinin maksimize etmek için, biz donma-çözülme döngüsü kaçınarak ve sadece bir kez dondurulmuş örnek kullanmanızı öneririz. Prosedür kısa sürede kusurlu Gi protein fonksiyonunun doğru tespiti sağlayan, çok basittir. Bu prosedürü kullanarak, asemptomatik ve scoliotic çocukların kolaylıkla daha iyi sağlık için herhangi bir tehlike olmadan klinik sonucunu tahmin etmek sınıflandırılabilir. HoSağlıklı kontrol grubunda 12 Gi uyarım göreli maksimum yanıtın derecesine göre sınıflandırma yaparken wever, kontrol grubu için çeşitli gerekler yerine getirilmelidir. Gerçekten de, uygun bir karşılaştırma kohort amacıyla, kontrol grubu ilaç her türlü olabilir ve bu gibi geçmiş bireysel / ailesel tıbbi geçmişi gibi özel bilgi sağlamak değil, yaş ve cinsiyet uyumlu olmalıdır. Bu gereksinimler kontrol konuların alımı için önemli bir engel teşkil edebilir. Bu nedenle, aynı bireyde Gi ve Gs protein uyarılmasına tepki arasındaki dengesizlik derecesini inceleyerek sınıflandırma performans denetimi konuları kullanmanın gerekliliğini ortadan kaldırmak için idealdir.
Bu testi gerçekleştirmek için prognostik CDS-dayalı bir sistemin kullanılması, aynı zamanda, aynı tahlilde Gi ve Gs-aracılı hücresel yanıtları sağlamak açısından önemlidir. Birçok hasta am ile sınıflandırılabilir rağmenbu raporun sonuçları ile gösterildiği gibi biguity Bu deney için sabit dinamik aralığı kullanılarak, hasta, az sayıda, aralıkları sınır çizgisine değerleri gösterirler. Bu bireyler ayrımcılık için, OPN üç fonksiyonel gruplar arasında Gi-aracılı hücresel cevap üzerinde bir etki fark neden olduğunu gösteren Gi tarafından uyarılmaya yanıt OPN etkisinin değerlendirilmesini girmiştik. Gerçekten de, OPN, FG1 Gi uyarım artışlara tepki varlığında bu FG2 daha yüksek bir oranda, FG2 ve FG3 de azalır bulundu. OPN maliyeti yüksek olmasına rağmen, bu kemokin kullanımı belirsiz durumlarda ayırt, ve bu nedenle sınıflandırma tahlil doğruluğunu geliştirmek için gereklidir. Bununla birlikte, bu deney, göz başına 1.5 x 10 5 hücre minimum deneysel koşullar altında CDS-tabanlı sistem ile hücresel cevabı gözlemlemek için gerekli olduğu bir dezavantajı vardır. Belirli hasta numuneleri, yeterli sayıda bir olmazTest edilecek olan hücreler. Bu durumda, medikal ve laboratuvar personeli için aileleri için endişe verici ve sinir bozucu olabilir ek kan toplama için hasta hatırlamak gerekir. Prospektif çalışmalar bu sorunu gidermek için laboratuarımızda planlanmaktadır.
Bununla birlikte, mevcut protokol test hücrelerin karşılıklarının izlenmesi için geçerli bir etiket içermeyen bir sistem 13, 14 kullanılarak otomatik olarak ise hücrelerini hazırlamak için basit ve kanıtlanmış bir yöntemle gerçekleştirilir. Diğer hastalıkların prognozu için mevcut genetik platform ile karşılaştırıldığında test platformu nispeten ucuzdur. Ayrıca, kan toplama tüpleri, ipuçları, özel elektrot mikroplaklar, ve konik ve Eppendorf tüpleri dahil tüm tek kullanımlık malzemelerin maliyeti, çok pahalı değil ve yaklaşık bin hasta için bir test tamamlamak için en az 3000 $ olarak tahmin ediliyor. Bu tahmin örneklerinin hazırlanması için işçilik maliyetleri içermez rağmenve testi, bu test çok daha uygun yeni nesil dizileme platformlarda daha kalır. Dikkate değer, genetik platformlara maliyet karşılaştırma değil sadece, ama daha spesifik AIS alanı ile ilgili, radyolojik görüntüleme ile ilgili maliyetleridir. Bugün, ABD'de bir milyondan fazla çocuk ve Kanada'da yaklaşık 100.000 çocuk idiopatik skolyoz tanısı, ve X-ray maruz kalma tanı ve scoliotic çocukların izlenmesi toplam maliyeti Kuzey Amerika'da yılda 2.5 milyar doların üzerinde olan. Böylece, hücre bazlı deney prosedürü rutin tarama ve sağlık riski olmaksızın ve daha düşük maliyetle idiyopatik skolyoz olan çocukların izlenmesi için uygun olması beklenecektir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma (Dr. Moreau'ya) La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Paris, Fransa hibe tarafından desteklenen, Sağlık Araştırma Kanada Enstitüleri (Dr Moreau'ya PP2-99466 hibe) ve Dördüncü Boyut Omurga LLC , New York, ABD (Dr Moreau'ya Araştırma hibe).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |