Un protocolo estructurado se presenta para un ensayo basado en células como una prueba funcional para predecir el pronóstico de la escoliosis idiopática usando espectroscopía dieléctrica celular (CDS). El ensayo puede realizarse con células mononucleares de sangre periférica frescas o congeladas (PBMCs) y el procedimiento se completa dentro de 4 días.
Este protocolo se detalla el procedimiento experimental y de análisis para un ensayo basado en células desarrollado en nuestro laboratorio como una prueba funcional para predecir el pronóstico de la escoliosis idiopática en niños asintomáticos y afectadas. El ensayo consiste en la evaluación del estado funcional de las proteínas Gi y GS en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) por espectroscopía dieléctrica celular (CDS), utilizando un instrumento automatizado basado CDS-, y la clasificación de los niños en tres grupos funcionales (FG1 , GD2, GD3) con respecto al perfil de desequilibrio entre el grado de respuesta a Gi y Gs proteínas estimulación. La clasificación se ve confirmado por el efecto diferencial de la osteopontina (OPN) en respuesta a la estimulación Gi entre los grupos y la severa progresión de la enfermedad es referenciado por FG2. Aproximadamente, se requiere un volumen de 10 ml de sangre para extraer las PBMC por gradiente de Ficoll-y las células entonces se almacenan en nitrógeno líquido. El número adecuado de PBMC para realizar el ensayo se obtiene después de dos días de cultivo celular. Esencialmente, las células se incubaron primero con phytohemmaglutinin (PHA). Después de 24 h de incubación, el medio se sustituye por un medio de cultivo con PHA libre para un 24 h adicionales antes de la siembra de células y el tratamiento de OPN. Después las células se espectroscópicamente examinados para sus respuestas a la somatostatina y el isoproterenol, que activan respectivamente las proteínas Gi y GS a través de sus receptores afines. Tanto la somatostatina y el isoproterenol se inyectan simultáneamente con un sistema integrado de fluidos y las respuestas de las células son monitoreados durante 15 min. El ensayo se puede realizar con PBMC frescas o congeladas y el procedimiento se completa dentro de 4 días.
Escoliosis idiopática es una deformación en la columna de causa desconocida que generalmente se define como una curvatura lateral mayor de 10 grados acompañados por una rotación vertebral 1. La condición afecta a un 4% de la población pediátrica y se diagnostica con mayor frecuencia entre las edades de 9 a 13 años 2,3,4. El diagnóstico es fundamentalmente de la exclusión y se hace sólo después de descartar otras causas de la deformidad de la columna, como la malformación vertebral, neuromusculares o trastornos sindrómicos. Tradicionalmente, la asimetría trunkal es revelada por Adams prueba de flexión hacia delante y se mide con scoliometer durante el examen físico 5. El diagnóstico puede ser confirmado por la observación radiográfica de la curva y la medición del ángulo utilizando el método de Cobb 6.
Una vez diagnosticada, la principal preocupación para los médicos en el manejo de los niños con escoliosis es si la curva va a progresar. De hecho, la progresión de la curva es a menudo impredecible yes observada entre las niñas con más frecuencia que en los niños 7. Si no se trata, la curva puede progresar de manera espectacular, creando una deformidad física significativa e incluso problemas cardiopulmonares. Estas manifestaciones se convierten en peligro la vida cuando la curva es superior a 70 ° 8,9. Las opciones actuales de tratamiento para prevenir o detener la progresión de la curva se incluyen refuerzos y cirugía. En general, se recomienda refuerzo de curvas entre 25-40 °, mientras que la cirugía se reserva para las curvas de más de 45 ° o que no responden al uso de órtesis.
Aproximadamente, el 10% de los niños diagnosticados con escoliosis idiopática tienen progresión de la curva que requiere cirugía correctiva 10. En la actualidad, no existe un método probado o prueba disponible para identificar este tipo de pacientes. En consecuencia, todos los niños diagnosticados son sometidos a múltiples radiografías durante varios años, por lo general hasta que alcanzan la madurez esquelética. Se estima que los pacientes típicos con escoliosis tendránaproximadamente 22 exámenes radiológicos más de un período de 3 años 11. Debido al riesgo potencial de múltiples exámenes radiográficos, los enfoques alternativos que podrían permitir realizar el pronóstico de la escoliosis idiopática, sin exponer a los niños a la radiación ionizante son muy deseables. Con la intención de satisfacer esta necesidad, hemos desarrollado previamente un ensayo de cribado basados en la célula como una prueba de pronóstico para identificar cuanto antes los niños asintomáticos con riesgo de desarrollar escoliosis idiopática. La prueba permite predecir el resultado clínico, tanto en niños asintomáticos y afectadas por el análisis del estado funcional de las proteínas Gi y clasificar a los niños en tres grupos funcionales (FG1, FG2 y FG3) de acuerdo con el grado de la respuesta máxima a la estimulación de proteínas Gi 12 tal como se mide por CDS sistema basado en. Este sistema se utiliza en gran medida para evaluar la transducción de señales a través de proteínas G en diversos tipos de células 13,14,15,16. Se da información sobre larespuesta total integrada de las células a los estímulos externos mediante la medición de cambios en la impedancia después de la activación de los receptores de la superficie celular. Las células se sembraron en microplacas que contienen electrodos en la parte inferior de los pocillos y el sistema aplica un pequeño voltaje que inducen corrientes extracelulares y transcelular. Después de la inyección del compuesto en el pozo, receptores de la superficie celular son estimulados y se producen los eventos de transducción de señal, dando lugar a cambios celulares que afectan el flujo de las corrientes extracelulares y transcelular, y por lo tanto afectan a la magnitud medida. Con este enfoque, los pacientes y los niños con escoliosis más en riesgo de desarrollar escoliosis son menos sensibles a la proteína Gi estimulación en comparación con los controles sanos, y la clasificación se basa en el porcentaje de grado de reducción en relación con el grupo control. Los rangos de clasificación se fijan entre 10 y 40% para FG3, 40 y 60% para FG2, y 60 y 90% para FG1 12.
<p class = "jove_content"> Más recientemente, se ha modificado este enfoque mediante la demostración de que los tres grupos funcionales se distinguen claramente de acuerdo al perfil de un desequilibrio entre la respuesta a Gi y Gs estimulación. De hecho, encontramos que la respuesta a la estimulación Gi predominó en FG3, mientras que no se observó desequilibrio aparente en FG2. Por el contrario, FG1 exhibió predominio de la respuesta a la estimulación Gs. Además, hemos proporcionado la evidencia de que los pacientes pertenecientes a FG2 están en mayor riesgo de progresar hasta el punto de necesitar la cirugía 17. La precisión de esta prueba de clasificación Además, se ha mejorado mediante la demostración de un efecto diferencial de la osteopontina (OPN) en respuesta a la estimulación Gi entre los grupos funcionales.Aquí documentamos los pasos detallados de los procedimientos experimentales y analíticas de la prueba de funcionamiento en la actualidad se realiza en nuestro laboratorio.
Hemos descrito un procedimiento detallado de una prueba basada en células pronóstico de la escoliosis idiopática, que es aplicable a las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) recién aisladas o conservado congelado hasta por un año en el nitrógeno líquido. Dado que el uso PBMCs aisladas recientemente es engorroso al probar gran número de personas, el procedimiento se presentó con PBMC congelados que ofrecen una alternativa más práctica en el ámbito clínico. Sin embargo, se encontraron problemas con la aglutinación de células después de la descongelación cuando se utilizaron inicialmente CMSP congeladas, lo que lleva a veces a la variabilidad inter-ensayo. Para maximizar la reproducibilidad del ensayo, se recomienda evitar el ciclo de congelación-descongelación y el uso de la muestra congelada sólo una vez. El procedimiento es muy sencillo, lo que permite una detección precisa de la función de la proteína Gi defectuoso en un corto período de tiempo. Usando este procedimiento, los niños asintomáticos y escolióticas se pueden clasificar fácilmente para predecir mejor su evolución clínica sin ningún peligro para su salud. Hobargo, cuando se realiza la clasificación de acuerdo con el grado de máxima respuesta a Gi estimulación en relación con los sujetos control sanos 12, debe cumplirse una serie de requisitos para los sujetos de control. De hecho, con el fin de tener una cohorte de comparación adecuada, los sujetos de control debe ser la edad y acompañado de género, no puede estar en cualquier tipo de medicación, y proporcionar información privada, como la historia pasado individual / familiar médica. Estos requisitos pueden constituir un obstáculo importante para el reclutamiento de los sujetos de control. Por lo tanto, la realización de clasificación mediante el examen del grado de desequilibrio entre la respuesta a Gi y Gs proteína de estimulación en el mismo individuo es ideal para eliminar la necesidad de utilizar los sujetos de control.
El uso del sistema basado en CDS-para llevar a cabo esta prueba de pronóstico es significativa en términos de proporcionar simultáneamente Gi-y las respuestas celulares mediadas por Gs en el mismo ensayo. Aunque muchos pacientes se pueden clasificar sin amambigüedad usando el rango dinámico fijo para este ensayo, un pequeño número de pacientes se exhibir valores en el límite de rangos, como se ilustra por los resultados del presente informe. Para discriminar estos individuos, hemos introducido la evaluación del efecto de OPN en respuesta a la estimulación Gi mediante la demostración de que la OPN induce un efecto diferencial sobre la respuesta celular mediada por Gi entre los tres grupos funcionales. De hecho, encontramos que en presencia de OPN, respuesta a Gi de estimulación aumenta en FG1, mientras que disminuye en FG2 y GD3, en un grado mayor en FG2. A pesar de los altos costos de OPN, el uso de esta quimiocina es esencial para distinguir los casos ambiguos, y por lo tanto mejorar la precisión de nuestro ensayo de clasificación. Sin embargo, este ensayo tiene la desventaja de que se requiere un mínimo de 1,5 x 10 5 células por pocillo para observar la respuesta celular con el sistema basado CDS-bajo nuestras condiciones experimentales. Ciertas muestras de los pacientes no tienen un número suficiente decélulas para ser probados. En este caso, es necesario recordar a los pacientes durante la extracción de sangre adicional, que puede ser preocupante para las familias y frustrante para el personal médico y de laboratorio. Se planean estudios futuros en nuestro laboratorio para abordar esta cuestión.
Sin embargo, el protocolo actual se basa en métodos simples y probadas para preparar células mientras que la prueba se automatiza utilizando un sistema libre de etiquetas validado 13, 14 para monitorear las respuestas de las células. La plataforma de pruebas es relativamente barato en comparación con la plataforma genética disponible para el pronóstico de otras enfermedades. Además, el costo de todos los materiales desechables, incluyendo los tubos de recogida de sangre, consejos, el electrodo especial microplacas y cónica y tubos Eppendorf, no es muy caro y se estima en menos de 3.000 dólares para completar una prueba de aproximadamente mil pacientes. Aunque esta estimación no incluye los costos de mano de obra para la preparación de muestrasy la realización de la prueba, esta prueba sigue siendo considerablemente más asequible que las plataformas de secuenciación de próxima generación. Digno de mención, es no sólo la comparación de costos a las plataformas genéticas, pero más específicamente relacionados con el campo de la AIS, es decir los costos asociados a las imágenes radiológicas. Hoy en día, más de un millón de niños en los EE.UU. y alrededor de 100 mil niños en Canadá son diagnosticados con escoliosis idiopática, y el costo total de diagnóstico y seguimiento de los niños con escoliosis por exposición a los rayos X es de más de 2,5 mil millones de dólares anuales en América del Norte. Por lo tanto, se esperaría que nuestro procedimiento de ensayo basado en células para ser adecuado para la detección y seguimiento de los niños con escoliosis idiopática sin riesgo para la salud y a un menor coste de rutina.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por becas de La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, París, Francia (a Dr. Moreau), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (Grant PP2-99466 con el Dr. Moreau) y de Cuarta Dimensión Spine LLC , Nueva York, EE.UU. (Beca de investigación del Dr. Moreau).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |