Summary

Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

Published: February 07, 2013
doi:

Summary

Hier beschrijven we een test voor groei<em> Staphylococcus aureus</em> Met hemoglobine als de enige bron van beschikbare voedingsstoffen ijzer. Deze test wordt de rol van bacteriële factoren betrokken bij hemoglobine-afgeleide ijzer aankoop.

Abstract

S. aureus is een pathogene bacterie die vereist ijzer uitvoeren vitale metabole functies en ziekte veroorzaken. De meest voorkomende reservoir van ijzer in de menselijke gastheer is heem, de cofactor van hemoglobine. Om ijzer te nemen van hemoglobine, S. aureus maakt gebruik van een uitgebreid systeem dat bekend staat als het ijzer-gereguleerde oppervlak determinant (ISD)-systeem 1. Onderdelen van de Isd systeem eerst binden gastheer hemoglobine, dan halen en importeren heem, en tenslotte ijzer te bevrijden van heem in het bacteriële cytoplasma 2,3. Deze route is ontleed door tal van in vitro studies 4-9. Verder is de bijdrage van de ISD-systeem om infecties al herhaaldelijk aangetoond in muismodellen 8,10-14. Tot vaststelling van de bijdrage van de ISD-systeem aan hemoglobine-afgeleide ijzer acquisitie en de groei heeft bewezen meer uitdagend. Groei assays met hemoglobine als enige ijzerbron ingewikkeld by de instabiliteit van commercieel beschikbare hemoglobine, verontreinigende vrij ijzer in het groeimedium en toxiciteit van ijzerchelatoren. Hier wordt een methode die deze beperkingen overwinnen. Hoogwaardige hemoglobine wordt bereid uit vers bloed en opgeslagen in vloeibare stikstof. Gezuiverd hemoglobine wordt aangevuld in ijzer-afbrekende medium nabootsen van de ijzer-arme omgeving waarmee ziekteverwekkers in de gewervelde gastheer. Door honger S. aureus vrij ijzer en aangevuld met een minimaal gemanipuleerde vorm van hemoglobine we groei te induceren op een wijze die volledig afhankelijk is van het vermogen om hemoglobine binden, extract heem passeren heem door de bacteriële cel envelop en afgebroken heem in het cytoplasma. Deze test zal nuttig zijn voor onderzoekers die aan de mechanismen van hemoglobin-/heme-derived ijzer acquisitie toe te lichten in S. aureus en eventueel andere bacteriële pathogenen.

Protocol

1. Zuivering van Hemoglobine van Fresh Blood De verwerving van nieuwe menselijk bloed aangevuld met een antistollingsmiddel. Houden bloed op ijs of bij 4 ° C gedurende de zuivering. Centrifugeer bloed gedurende 20 min bij 1500 x g. De rode bloedcellen (RBC's) zullen op de bodem van de buis. Zorgvuldig aspireren de supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig in ijskoude 0,9% (w / v) NaCl-oplossing. Centrifugeer nogmaals en was 3 keer. Resuspendeer de pellet in 1 volume ijskoude 1…

Representative Results

We hebben gezuiverd humaan hemoglobine uit hemolysaat met HPLC (Protocol stap 1.7). Figuur 1 toont opgenomen absorptie van het eluaat bij 280 en 410 nm golflengte. Fractie 5 werd verzameld en andere fracties werden weggegooid. Opbrengsten van vijf tot vijftien milligram per milliliter hemoglobine eluaat worden meestal verkregen. Gezuiverd hemoglobine werd geanalyseerd door SDS-PAGE in tweevoud werden de gelen ofwel gekleurd eiwitten of overgebracht op nitrocellulose en immunoblotting (Protocol stap 1,10…

Discussion

IJzer is een essentiële voedingsstof die door organismen van alle koninkrijken van het leven 15. In gewervelde dieren, is ijzer afgezonderd om toxiciteit veroorzaakt door dit element te voorkomen. Deze opslag verbergt ook ijzer van microben in een proces dat bekend staat als nutritionele immuniteit 16. In reactie hierop hebben ziekteverwekkers geëvolueerd strategieën die voedingswaarde immuniteit te omzeilen. Een dergelijk mechanisme is gebaseerd op hemoglobine, de meest voorkomende bron van ijz…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd ondersteund door US Public Health Service subsidies AI69233 en AI073843 van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten. EPS is een Burroughs Wellcome Fellow in de pathogenese van infectieziekten. KPH werd gefinancierd door de Cellulaire en Moleculaire Microbiologie Training subsidie ​​Programma 5 T32 A107611-10.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin’s reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

Referenzen

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemie. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C., Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

View Video