Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro
Summary
Aquí se describe un ensayo de crecimiento para<em> Staphylococcus aureus</em> Usando hemoglobina como la única fuente de hierro nutrientes disponibles. Este ensayo establece el papel de los factores bacterianos implicados en la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro.
Abstract
S. aureus es una bacteria patógena que requiere de hierro para llevar a cabo las funciones metabólicas vitales y causan enfermedades. El depósito más abundante de hierro en el interior del huésped humano es heme, que es el cofactor de la hemoglobina. Para adquirir el hierro de la hemoglobina, S. aureus utiliza un complejo sistema conocido como el determinante superficie regulada por hierro (Isd) del sistema 1. Los componentes del sistema Isd primero hemoglobina anfitrión bind, a continuación, extraer e importar hemo, y, finalmente, liberar el hierro del grupo hemo en el citoplasma bacteriano 2,3. Esta vía ha sido diseccionado a través de numerosos estudios in vitro 4-9. Además, la contribución del sistema de Isd a la infección se ha demostrado repetidamente en modelos de ratón 8,10-14. El establecimiento de la contribución del sistema de Isd a la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro y crecimiento ha demostrado ser más difícil. Ensayos de crecimiento usando hemoglobina como única fuente de hierro son complicadas by la inestabilidad de la hemoglobina disponible comercialmente, contaminando hierro libre en el medio de crecimiento, y la toxicidad asociada con quelantes de hierro. Aquí presentamos un método que supera estas limitaciones. Hemoglobina de alta calidad se preparó a partir de sangre fresca y se almacena en nitrógeno líquido. Hemoglobina purificada se completa en hierro-agotan medio que imitan el entorno pobre en hierro encontrada por patógenos dentro del huésped vertebrado. Al privar S. aureus de hierro libre y se completa con una forma mínimamente manipulados de hemoglobina que inducir el crecimiento de una manera que es totalmente dependiente de la capacidad de unirse a la hemoglobina, extraer hemo, heme pasar a través de la envoltura celular bacteriana y degradar hemo en el citoplasma. Este ensayo será útil para los investigadores que buscan para dilucidar los mecanismos de adquisición de hierro hemoglobin-/heme-derived en S. aureus y posiblemente otros patógenos bacterianos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El hierro es un nutriente esencial requerido por los organismos de todos los reinos de la vida 15. En los vertebrados, el hierro es retenido para evitar la toxicidad causada por este elemento. Este secuestro también oculta de hierro de los microbios invasores en un proceso conocido como inmunidad nutricional 16. En respuesta, los patógenos han desarrollado estrategias que evitan la inmunidad nutricional. Uno de estos mecanismos depende de la hemoglobina, que es la fuente más abundante de hierro …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por los EE.UU. Servicio de Salud Pública de subvenciones AI69233 y AI073843 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. EPS es un compañero Burroughs Wellcome en la patogénesis de las enfermedades infecciosas. KPH fue financiado por el Celular y Molecular Microbiología Programa de Entrenamiento de subvención T32 5 A107611-10.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| HPLC anion exchange column | Varian | PL1551-3802 | |
| Drabkin’s reagent | Sigma | D5941-6VL | |
| Hemoglobin standard | Pointe Scientific | H7506-STD | |
| RPMI | HyClone | SH30011.02 | |
| Chelex 100 sodium form | Sigma | C7901 | |
| EDDHA | LGC Standards GmbH | ANC 001 | |
| Hemoglobin a antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-21005 | |
| Tryptic soy agar | BD | 236920 |
Referenzen
- Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
- Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
- Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
- Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
- Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
- Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
- Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
- Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
- Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
- Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
- Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
- Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
- Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
- Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
- Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
- Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
- Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
- Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
- Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
- Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
- Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemie. 46, 10675-10684 (2007).
- Williams, R. C., Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
- Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
- Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
- Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
- Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
- Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).
