Summary

Staphylococcus aureus Wachstum mit menschlichen Hämoglobins als Eisenquelle

Published: February 07, 2013
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein Wachstum Assay für<em> Staphylococcus aureus</em> Mit Hämoglobin als die alleinige Quelle der verfügbaren Nährstoff Eisen. Dieser Test stellt die Rolle der bakteriellen Faktoren in Hämoglobin-derived Eisenaufnahme beteiligt.

Abstract

S. aureus ist ein Bakterium, das Eisen durchzuführen lebenswichtige Stoffwechselfunktionen und Krankheiten verursachen erfordert. Das häufigste Reservoir von Eisen im menschlichen Wirt Häm, das der Cofaktor von Hämoglobin ist. Eisen aus Hämoglobin erwerben, S. aureus nutzt ein ausgeklügeltes System, wie der Eisen-regulierten Oberfläche Determinante (Isd) System 1 bekannt. Komponenten des Isd System zuerst bind Host Hämoglobin, dann extrahieren und importieren Häm, und schließlich befreien Eisen aus Häm in dem bakteriellen Zytoplasma 2,3. Dieser Weg ist durch zahlreiche in-vitro-Studien 4-9 wurden seziert. Ferner hat der Beitrag des Isd-System auf eine Infektion immer wieder in Mausmodellen 8,10-14 demonstriert. Gründung der Beitrag des Isd System Hämoglobin-abgeleiteten Eisenaufnahme und das Wachstum hat sich als größere Herausforderung. Growth Assays mit Hämoglobin als einziger Eisenquelle kompliziert by die Instabilität von handelsüblichen Hämoglobin, kontaminierenden freiem Eisen im Nährmedium und Toxizität mit Eisenchelatoren verbunden. Hier präsentieren wir eine Methode, die diese Beschränkungen überwindet. Hochqualitative Hämoglobin wird aus frischem Blut hergestellt und in flüssigem Stickstoff gelagert. Gereinigtes Hämoglobin in ergänzt Eisen-Abbau Mediums imitiert die Eisen-armen Umgebung von Krankheitserregern in der Wirbeltier-Wirt gestoßen. Von hungernden S. aureus von freiem Eisen und Ergänzung mit einer minimal manipulierte Form von Hämoglobin zu induzieren wir Wachstum in einer Weise, die völlig abhängig von der Fähigkeit, Hämoglobin binden, zu extrahieren Häm, Häm passieren durch die bakterielle Zellwand und degradieren Häm im Zytoplasma ist. Dieser Test wird für Forscher, die die Mechanismen der hemoglobin-/heme-derived Eisenaufnahme in S. aufzuklären nützlich aureus und möglicherweise auch andere bakterielle Erreger.

Protocol

Ein. Reinigung von Hämoglobin aus frischem Blut Erwerben frisches menschliches Blut mit einem Antikoagulans ergänzt. Halten Sie Blut auf Eis oder bei 4 ° C während der Reinigung. Zentrifuge Blut für 20 min bei 1.500 x g beträgt. Die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) wird am Boden der Röhre liegen. Vorsichtig den Überstand aspirieren und sanft das Pellet in eiskaltem 0,9% (w / v) NaCl-Lösung. Wiederholen Sie die Zentrifugation und 3 x waschen. Das Pellet in 1 Volumen eiskaltem 1…

Representative Results

Wir haben gereinigtes humanes Hämoglobin aus Hämolysat mit HPLC (Protocol Schritt 1,7). Abbildung 1 zeigt aufgezeichnete Absorption des Eluats bei 280 und 410 nm Wellenlänge. Fraktion 5 wurde gesammelt und anderen Fraktionen wurden verworfen. Ausbeuten von fünf bis fünfzehn Milligramm Hämoglobin pro Milliliter des Eluats werden typischerweise erworben. Gereinigtes Hämoglobin wurde durch SDS-PAGE analysiert und in doppelter Ausführung wurden die Gele entweder für Proteine ​​gefärbt oder auf…

Discussion

Eisen ist ein wichtiger Nährstoff, die durch Organismen aus allen Reichen des Lebens 15 erforderlich. Bei Wirbeltieren wird Eisen sequestriert, um die Toxizität von diesem Element zu vermeiden. Diese Sequestrierung birgt auch Eisen aus eindringende Mikroben in einem Prozess als Nahrungsergänzungsmittel Immunität 16 bekannt. In Reaktion darauf haben die Erreger Strategien, Ernährung Immunität zu umgehen entwickelt. Ein solcher Mechanismus beruht auf Hämoglobin, das ist der häufigste Quelle v…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der US Public Health Service Zuschüsse AI69233 und AI073843 aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases unterstützt. EPS ist ein Burroughs Wellcome Fellow in der Pathogenese von Infektionskrankheiten. KPH wurde von der Cellular and Molecular Microbiology Training Grant Program 5 T32 A107611-10 finanziert.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin’s reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

Referenzen

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemie. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C., Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).

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Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

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