Summary

Une procédure optimisée pour Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) Isolement du système nerveux autonome progéniteurs neuronaux de viscères de souris sur le fœtus

Published: August 17, 2012
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Summary

Une procédure optimisée pour purifier la crête neurale-dérivés progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris est décrite. Cette méthode tire parti d'expression parmi les allèles rapporteurs fluorescents d'isoler des populations distinctes par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). La technique peut être appliquée pour isoler les sous-populations neuronales au cours du développement ou de tissus adultes.

Abstract

Au cours du développement de la crête neurale (NC) dérivés de progéniteurs neuronaux migrer loin du tube neural pour former ganglions autonomes dans les organes viscéraux comme l'intestin et du tractus urinaire inférieur. Les deux cours du développement et dans les tissus matures ces cellules sont souvent très dispersés à travers les tissus de telle sorte que l'isolement des populations discrètes en utilisant des méthodes comme la capture laser micro-dissection est difficile. Ils peuvent cependant être directement visualisée par l'expression de journalistes fluorescentes chassés de régions régulatrices de gènes spécifiques des neurones comme la tyrosine hydroxylase (TH). Nous décrivons une méthode optimisée pour des rendements élevés de TH viable + de progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris viscérales, y compris l'intestin et inférieure du tractus urogénital (LUT), fondée sur la dissociation et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

Le gène codant pour la Th enzyme limitante pour la production de catécholamines. Entériques progéniteurs neuronaux commencent à exprimer TH durIng leur migration dans l'intestin du fœtus 1 et TH est également présent dans un sous-ensemble de neurones des ganglions pelviens adultes 2-4. La première apparition de cette lignée et la distribution de ces neurones dans d'autres aspects de la LUT, et leur isolement n'a pas été décrite. Progéniteurs neuronaux exprimant TH peut être facilement visualisées par l'expression de l'EGFP dans des souris porteuses du transgène construction Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Nous imagée expression de ce transgène dans des souris fœtales afin de documenter la distribution de TH + cellules dans la LUT développer à 15,5 coït jours après (DPC), désignant le matin de la détection prise de 0,5 jpc, et a observé que un sous-ensemble des progéniteurs neuronaux dans la coalescence pelvienne ganglions expresse EGFP.

Pour isoler TH + LUT progéniteurs neuronaux, nous avons optimisé les méthodes qui ont été initialement utilisés pour purifier les cellules souches neurales de crête de l'intestin de souris fœtale 2-6. Efforts antérieurs visant à isoler NC dérivés populations invoquésdigestion avec un cocktail de collagénase et de la trypsine pour obtenir des suspensions cellulaires pour la cytométrie en flux. Dans nos mains ces méthodes ont produit des suspensions cellulaires de la LUT avec la viabilité relativement faible. Compte tenu de l'incidence déjà faible de progéniteurs neuronaux dans les tissus fœtaux LUT, nous avons décidé d'optimiser les méthodes de dissociation de telle sorte que la survie des cellules dans les dissocie finales serait augmenté. Nous avons déterminé que douce dissociation dans Accumax (Cell Technologies innovantes, Inc), filtrage manuel, et le débit de tri à de faibles pressions nous ont permis d'atteindre la survie constamment supérieur (> 70% des cellules totales) avec des rendements ultérieurs de progéniteurs neuronaux suffisants pour l'analyse en aval. La méthode que nous décrivons peut être largement appliquée à isoler une variété de populations neuronales foetales à partir soit ou adulte tissus murins.

Protocol

1. Préparation des médias (Toutes les étapes de fait dans la hotte de culture tissulaire) Mélanger le suivant: 44 L-15 ml de milieu, 0,5 ml 100X pénicilline / streptomycine (P / S), 0,5 ml à 100 mg / ml de sérumalbumine bovine (BSA), 0,5 ml de HEPES 1M, 5 ml de tissus de qualité de l'eau de la culture. Assurez-vous de mélanger BSA et P / S avant d'ajouter. Ce volume devrait être suffisant pour la dissociation d'un maximum de cinq différents types de tissus. Ce support sera utilisé à l…

Discussion

Lignes journaliste de souris exprimant journalistes fluorescentes sont de plus en largement disponibles grâce à des efforts multiples dans le milieu de la génétique murine 1,8,9. En conséquence, la méthode de la dissociation illustré ici peut être largement appliquée pour l'isolement de sous-types neuronaux distincts basés sur les profils d'expression des neurotransmetteurs ou des récepteurs de tissus fœtaux soit ou adulte. Alors que nous avons optimisé cette méthode basée sur l'exp…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Catherine Alford pour des suggestions sur les méthodes de dissociation cellulaire et Kevin Weller, David Flaherty et la Bretagne Matlock pour le soutien à la ressource partagée cytométrie en flux à la Vanderbilt University Medical Center et Melissa A. Musser d'assistance artistique avec des illustrations. Nous remercions les Drs. Jack Mosher et Sean Morrison pour obtenir des conseils sur la mise en œuvre d'isolement des progéniteurs neuronaux. Le flux de ressource partagée MVC cytométrie est pris en charge par le Centre du cancer Vanderbilt Ingram (P30 CA68485) et la Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Ce travail a été soutenu par un financement à partir de US National Institutes of Health des subventions DK064251, DK086594, et DK070219.

Materials

Reagent Name Vendor Catalog number Comments
Accumax Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) A7089-100ML Store frozen in 1 ml aliquots
DNase I Sigma D-4527 Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS,
(Used in Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7.4 Gibco 70011-044 Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
10X HBSS w/o Ca or Mg Gibco 14185-052 Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 21083027  
Penicillin /Streptomycin 100X Gibco 15140-133 Store aliquoted at -20 °C
BSA Sigma A3912-100G Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl Lonza 17-737E  
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane Sefar America 3-38/22 Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
7-AAD Invitrogen A1310 1 mg/ml
TRIzol LS Invitrogen 10296-028  
5 ml polystyrene tubes Falcon 352058  
15 ml conical tubes Corning 430790  
Fine Dissecting Forceps Fine Science Instruments 11251-30 Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm
Dissecting Spoon Fine Science Instruments 10370-18  

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Buehler, D. P., Wiese, C. B., Skelton, S. B., Southard-Smith, E. M. An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice. J. Vis. Exp. (66), e4188, doi:10.3791/4188 (2012).

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