وهو الإجراء الأمثل لالإسفار تنشيط عزل الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) فرز الأسلاف العصبية الاستقلال الذاتي من الجهاز التنفسي والهضمي من الفئران الجنينية
Summary
يوصف إجراء الأمثل لتنقية العرف العصبي المستمدة من الأسلاف من الأنسجة العصبية الماوس الجنين. هذا الأسلوب يستفيد من التعبير من الأليلات مراسل فلوري لعزل السكان منفصلة عن طريق الفرز الخلية مضان تنشيط (FACS). ويمكن تطبيق هذه التقنية لعزل القطعان الخلايا العصبية في جميع أنحاء تطوير أو من أنسجة البالغين.
Abstract
خلال تطوير العرف العصبي (NC) المستمدة من الأسلاف العصبية تهاجر بعيدا عن الأنبوب العصبي اللاإرادي لتشكيل العقد في الجهاز التنفسي والهضمي مثل الأمعاء والمسالك البولية السفلية. على حد سواء خلال تطوير والأنسجة الناضجة غالبا ما تكون هذه الخلايا على نطاق واسع في جميع أنحاء متفرقة الأنسجة بحيث عزلة السكان منفصلة باستخدام أساليب مثل القبض على الليزر الدقيقة تشريح أمر صعب. يمكن أن تكون إلا تصور مباشرة من قبل التعبير عن صحفيين فلوري طردوا من المناطق التنظيمية من الخلايا العصبية جينات محددة مثل هيدروكسيلاز التيروسين (TH). نحن وصفا لطريقة الأمثل لعوائد عالية من TH قابلة للحياة + الأسلاف من الأنسجة العصبية الماوس الجنين الحشوية، بما في ذلك الأمعاء والجهاز البولي التناسلي السفلي (LUT)، استنادا إلى التفكك ومضان تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية).
الجين بترميز ث الحد من معدل انزيم لإنتاج الكاتيكولامينات. الأسلاف العصبية المعوية يبدأ في التعبير عن TH الدرجى هجرتهم في الأمعاء الجنين 1 و TH موجود أيضا في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية للبالغين العقد الحوض 2-4. لم يكن أول ظهور لهذه السلالة، وتوزيع هذه الخلايا العصبية في الجوانب الأخرى من الطرفيات، وعزلتهم وصفها. ويمكن التعبير عن الأسلاف العصبية TH يمكن تصور بسهولة من قبل التعبير عن EGFP في الفئران التي تحمل التصور التحوير تيراغرام (TH-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. التقط لنا التعبير عن هذا التحوير في الفئران الجنينية لتوثيق توزيع TH + الخلايا في LUT النامية على 15،5 الجماع آخر أيام (DPC)، تعيين صباح الكشف عن المكونات إلى 0.5 DPC، وأشار إلى أن مجموعة فرعية من أسلاف الخلايا العصبية في ائتلافه العقد الحوضية صريحة EGFP.
لعزل TH LUT + أسلاف الخلايا العصبية، إلى أقصى حد نحن الأساليب التي استخدمت في البداية لتنقية الخلايا الجذعية العصبية قمة من الأمعاء الماوس الجنين 2-6. قبل جهودا لعزل NC المستمدة من السكان يعتمد عليهاالهضم مع مزيج من كولاجيناز والتربسين للحصول على تعليق خلية لالتدفق الخلوي. في أيدينا تنتج هذه الأساليب تعليق خلية من LUT مع بقاء منخفض نسبيا. نظرا للمعدلات المتدنية أصلا من أسلاف الخلايا العصبية في أنسجة الجنين LUT، شرعنا في تحسين أساليب تفارق تلك التي من شأنها أن تكون زيادة بقاء الخلايا في تنأى النهائي. نحن مصممون على أن تفكك لطيف في Accumax (تقنيات خلية المبتكرة، المؤتمر الوطني العراقي)، والترشيح اليدوي، وتدفق الفرز في ضغط منخفض سمحت لنا لتحقيق قدر أكبر من البقاء على قيد الحياة على الدوام (> 70٪ من مجموع الخلايا) مع الغلة لاحق من الأسلاف العصبية كافية لتحليل اتجاه مجرى النهر. ويمكن لأسلوب وصفنا تطبيقها على نطاق واسع لعزل مجموعة متنوعة من السكان من الأنسجة العصبية إما الفئران الجنينية أو الكبار.
Protocol
Discussion
خطوط مراسل الماوس التعبير للصحفيين فلوري أصبحت متاحة على نطاق واسع من خلال جهود متعددة في المجتمع الوراثة الفئران 1،8،9. ويمكن نتيجة لذلك تكون الطريقة تفكك يتضح هنا يطبق على نطاق واسع لعزل الخلايا العصبية فرعية منفصلة على أساس عصبي أو أنماط التعبير مستقبلات إما…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر كاثرين الفورد للحصول على اقتراحات حول خلية تفكك الأساليب ويلر كيفين، فلاهيرتي ديفيد ماتلوك وبريتاني للحصول على الدعم في تدفق الموارد الخلوي المشتركة في مركز جامعة فاندربيلت الطبي، وميليسا مسر ألف للحصول على المساعدة الفنية مع الرسوم التوضيحية. نشكر الدكاترة. موشر جاك موريسون وشون لتقديم المشورة بشأن تنفيذ العزلة من أسلاف الخلايا العصبية. ويدعم هذا التدفق الخلوي VMC مورد مشترك من قبل مركز فاندربيلت السرطان انجرام (P30 CA68485) ومرض في الجهاز الهضمي فاندربيلت مركز أبحاث (P30 DK058404). وأيد هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح DK064251، DK086594، وDK070219.
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
Referenzen
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Kruger, G. M. Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness. Neuron. 35, 657-669 (2002).
- Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity. Neuron. 35, 643-656 (2002).
- Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Morrison, S. J. . Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).
- Skarnes, W. C. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Harding, S. D. The GUDMAP database–an online resource for genitourinary research. Development. 138, 2845-2853 (2011).
- Joseph, N. M. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
- Newgreen, D. F., Murphy, M. Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration. Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).
