태아 쥐의 내장 장기에서 자율 신경 Progenitors의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 절연을위한 최적화된 절차
Summary
태아 마우스 조직에서 신경 능선 – 파생의 연결을 progenitors 정화 최적화된 절차를 설명합니다. 이 방법은 형광 활성화된 셀 정렬 (FACS)에 의해 이산 인구를 분리하기 위해 형광등 기자 대립 유전자로부터 표현의 활용합니다. 기술은 개발 전반에 걸쳐 또는 성인 조직에서 subpopulations의 연결을 분리하여 적용할 수 있습니다.
Abstract
개발에 신경 능선 (NC) 중 – 파생의 연결을 progenitors은 소장 및 하부 요로 같은 내장 기관의 자율 신경 구를 형성하는 신경 관에서 떨어져 마이 그 레이션. 레이저 캡처 마이크로 절개와 같은 방법을 사용하여 이산 인구의 분리가 어려운 있도록 개발 중에 성숙한 조직에서이 두 세포는 종종 광범위하게 조직 전체에 분산됩니다. 그들은 그러나 티로신 hydroxylase (TH)와 같은 신경 세포에 특정한 유전자의 규제 영역에서 구동 형광등 기자의 표현에 의해 직접적으로 시각이 될 수 있습니다. 우리는 가능한 TH 높은 수율 + 소장하고 분리와 형광 – 활성 셀 정렬 (FACS)를 기반으로 더 낮은 urogenital 요로 (LUT)을 포함하여 태아의 마우스를 내장 조직에서 progenitors의 연결을 위해 최적화된 방법을 설명합니다.
번째 유전자는 catecholamines의 생산을위한 속도 – 제한 효소를 인코딩합니다. 장용의 연결을 progenitors는 TH 두어을 표현하기 시작태아 소장 1과 TH들의 이주를 접근한 것은 또한 성인 골반 신경의 뉴런 2-4 집합에 속해 있습니다. 이 혈통 이러한 LUT의 다른 측면에서 뉴런, 그들의 고립 배포의 첫 번째 모습이 설명되지 않았습니다. TH 표현의 연결을 progenitors은 transgene 구조 TG (TH-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1 나르는 생쥐에서 EGFP 표현하여 쉽게 시각이 될 수 있습니다. 우리는 0.5 dpc으로 플러그 검출의 아침을 지정, 15.5 일 게시물 성교 (dpc)에서 개발 LUT에서 TH의 배포판 + 세포를 문서화하는 태아 생쥐에서 transgene 표현 몇 군데, 그리고 관찰 그 coalescing에의 연결을 progenitors의 부분 집합 골반 신경 표현 EGFP.
LUT TH +의 연결을 progenitors를 분리하기 위해, 우리는 초기에 태아의 마우스 소장 2-6에서 신경 능선의 줄기 세포를 정화하는 데 사용된 방법을 최적화. 이정표로 삼았죠 NC-파생 인구를 분리하기 위해 이전의 노력유동세포계측법위한 세포 현탁액을 얻을 수 collagenase와 트립신의 칵테일과 소화. 우리 손에 이러한 방법은 상대적으로 낮은 생존과 LUT에서 세포 현탁액을 생산했다. 태아 LUT 조직에의 연결을 progenitors의 이미 낮은 발병률을 감안할 때, 우리는 최종 dissociates의 세포 생존을 증가된다는 등의 분리 방법을 최적화하기 위해 밖으로 설정합니다. 우리는이 스트림 분석을위한 충분한의 연결을 progenitors의 후속 수율과 함께 지속적으로 더 큰 생존 (총 세포의> 70 %) 달성 허용 낮은 압력에서 정렬을 그 잔잔한 Accumax의 분리 (혁신적인 휴대 기술, INC), 수동 필터링 및 흐름을 결정. 우리가 설명하는 방법은 크게 태아 또는 성인 murine 조직 중 하나의 연결에서 인구의 다양한 분리 적용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
형광 기자를 표출 마우스 기자 라인 murine 유전학 사회 1,8,9의 여러 노력으로 널리 사용되고있다. 따라서 여기에 그림과 분리 방법은 널리 태아 또는 성인 조직 중의 신경 전달 물질이나 수용체 발현 패턴을 바탕으로 이산의 연결을 subtypes의 고립을 위해 적용할 수 있습니다. 우리가 형광등 transgene 기자의 표현을 바탕으로이 방법을 최적화하고 있지만, 그것은 또한 라이브 셀 immuno-라벨링 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그림과 예술적인 도움 밴더빌트 대학 메디컬 센터와 멜리사 A. Musser에서 유동세포계측법 공유 자원의 지원을 세포 분리 방법과 케빈 Weller, 데이빗 레어 티 및 브르타뉴 맷락요에 대한 제안 캐서린 Alford 감사드립니다. 우리는 Drs 감사드립니다. 의 연결을 progenitors의 절연을 구현에 대한 조언 잭 Mosher와 숀 모리슨. VMC 유동세포계측법 공유 리소스는 밴더빌트 Ingram 암 센터 (P30 CA68485)와 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터 (P30 DK058404)에 의해 지원됩니다. 이 작품은 건강 보조금 DK064251, DK086594 및 DK070219의 미국 국립 연구소의 자금 지원에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
Referenzen
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Kruger, G. M. Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness. Neuron. 35, 657-669 (2002).
- Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity. Neuron. 35, 643-656 (2002).
- Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Morrison, S. J. . Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).
- Skarnes, W. C. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Harding, S. D. The GUDMAP database–an online resource for genitourinary research. Development. 138, 2845-2853 (2011).
- Joseph, N. M. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
- Newgreen, D. F., Murphy, M. Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration. Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).
