Er zijn twee methoden van Heterokaryon vorming van HCV Beperking Factoren Ontdek

Hepatitis C virus (HCV) is een hepatotrope virus met een gastheer-range beperkt tot mensen en chimpansees. Hoewel HCV-RNA-replicatie is waargenomen bij de mens niet-lever-en muizen cellijnen, het rendement was erg laag en de vereiste lange termijn selectieprocedures met HCV replicon bouwt uiten dominante antibiotica-selecteerbare merkers ^1-5. HCV-in-vitro-onderzoek is dan ook beperkt tot humane lever cellijnen permissief voor virus in-en voltooiing van de virale levenscyclus. Door de smalle soorten tropisme zware bedrijfsvoertuigen, is er geen immunocompetente klein diermodel beschikbaar bevorderen die voor de volledige HCV replicatiecyclus ^6-8. Inefficiënte replicatie van HCV in niet-menselijke cellen bijvoorbeeld van de muis herkomst is waarschijnlijk te wijten aan een gebrek aan genetische onverenigbaarheid van essentiële gastheer afhankelijkheid factoren en / of expressie van beperking factoren.

We hebben onderzocht of HCV voortplanting wordt onderdrukt door dominante beperking factors in een menselijke cellijnen afgeleid van niet-lever weefsels of muizenlever cellijnen. Hiervoor ontwikkelden we twee onafhankelijke voorwaardelijke trans-aanvulling methoden te vertrouwen op somatische celfusie. In beide gevallen voltooiing van de virale replicatie cyclus slechts mogelijk in de heterokaryons. Bijgevolg succesvolle trans-complementatie, die wordt bepaald door de novo productie van infectieuze virale nageslacht geeft geen dominerende beperkingen.

In het bijzonder werden subgenome HCV replicons het dragen van een luciferase transgen getransfecteerd in zeer tolerant humane lever cellen (Huh-7.5-cellen). Vervolgens werden deze cellen samen gekweekt en gefuseerd met verschillende menselijke en muizen cellen die HCV structurele eiwitten kern omhulling 1 en 2 (E1, E2) en extra eiwitten P7 en NS2. Mits celfusie werd gestart door behandeling met polyethyleenglycol (PEG), de cultuur vrijgegeven infectieuze virus paARTIKELEN die naïeve cellen die geïnfecteerd zijn in een receptor-afhankelijke manier.

Om de invloed van de dominante beperkingen op de volledige virale levenscyclus zoals mobiele toegang, RNA-vertaling, replicatie en assemblage virus te beoordelen, hebben we geprofiteerd van een menselijke lever cellijn (Huh-7 Lunet N cellen ^9), die endogene expressie van CD81 mist, essentieel ingang factor HCV. Aangezien ectopisch tot expressie CD81, deze cellen in wezen ongevoelig HCV infectie ^10. Belangrijk is dat bij gelijktijdige gekweekt en versmolten met cellen die de menselijke CD81 maar gebrek in ieder geval een andere cruciale celinvoer factor (dat wil zeggen SR-BI, CLDN1, OCLN) uit te drukken, alleen de resulterende heterokaryons weer te geven van de complete set van HCV toegang factoren vereiste voor de infectie. Daarom, om te analyseren als dominante beperking factoren onderdrukken voltooiing van de HCV replicatie cyclus, we Lunet N cellen gefuseerd met verschillende cellen van mens en muis oorsprong die de hierboven genoemde crit voldoenERIA. Als co-gekweekte cellen werden getransfecteerd met een zeer fusogeen virale manteleiwit mutant van de prototype schuimende virus (PFV ¹¹⁾ en vervolgens uitgedaagd met infectieuze HCV deeltjes (HCVcc) werd de novo productie van infectieus virus waargenomen. Dit geeft aan dat HCV succes zijn replicatie voltooid heterokaryons dus uitgesloten expressie van dominant beperking factoren deze cellijnen. Deze nieuwe voorwaardelijke trans-aanvulling methoden zal nuttig zijn om een groot panel van cellijnen en primaire cellen screenen voor de expressie van HCV-specifieke dominante beperking factoren.