Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren
Summary
Wir beschreiben zwei Methoden für die bedingte<em> Trans</em>-Komplementation des Hepatitis C Virus (HCV)-Anordnung und der Abschluss des vollständigen viralen Lebenszyklus, die auf Heterokaryon Bildung verlassen. Diese Techniken eignen sich zum Screening auf Zelllinien, die dominierende Einschränkung Faktoren, die Produktion von infektiösen HCV Nachkommen ausschließt auszudrücken.
Abstract
Hepatitis C Virus (HCV) ist ein hepatotropen Virus mit einem Host-Bereich beschränkt, um Menschen und Schimpansen. Obwohl HCV-RNA-Replikation in humanen nicht-hepatische und murinen Zelllinien beobachtet, war die Effizienz sehr gering und erforderliche langfristige Auswahlverfahren mit HCV-Replikon-Konstrukten, Antibiotika-dominante selektierbare Marker 1-5. HCV-in-vitro-Forschung ist daher die menschliche Hepatom-Zelllinien permissive für das Eindringen von Viren und die Fertigstellung des viralen Lebenszyklus beschränkt. Aufgrund schmalen Arten Tropismus HCVS, gibt es keine immunkompetenten Kleintiermodell zur Verfügung, die die vollständige HCV Replikationszyklus erhält 6-8. Ineffiziente Replikation von HCV in nicht-menschlichen Zellen, z. B. von der Maus stammt wahrscheinlich wegen des Mangels an genetische Unverträglichkeit wesentlicher Host Abhängigkeit Faktoren und / oder Expression von Restriktionsfaktoren.
Wir untersuchten, ob HCV-Vermehrung durch dominante Beschränkung fa wird unterdrücktctors entweder in humanen Zelllinien von nicht-hepatischen Geweben oder in der Leber der Maus-Zelllinien abgeleitet. Zu diesem Zweck haben wir zwei unabhängige bedingten trans-Komplementierung Verfahren, die auf somatische Zellfusion. In beiden Fällen ist die Vollendung des viralen Replikationszyklus nur in den Heterokaryons. Folglich zeigt die erfolgreiche trans-Komplementierung, die durch Messung de novo Produktion von infektiösen viralen Nachkommen bestimmt wird, dass kein beherrschender Beschränkungen.
Im Einzelnen wurden subgenomischen HCV-Replikons Tragen eines Luciferase Transgens in sehr freizügigen menschlichen Hepatom-Zellen (Huh-7.5-Zellen) transfiziert. Anschließend wurden diese Zellen co-kultiviert und die mit verschiedenen humanen und murinen Zellen, die HCV-Strukturproteine Kern Hülle 1 und 2 (E1, E2) und akzessorische Proteine p7 und NS2. Vorausgesetzt, dass Zellfusion durch Behandlung mit Polyethylenglykol (PEG) initiiert wurde, veröffentlichte die Kultur infektiösen viralen partikel die naiven Zellen in einem Rezeptor-abhängigen Weise infiziert.
Um den Einfluss der beherrschenden Beschränkungen des gesamten viralen Lebenszyklus, einschließlich Eintritt in die Zelle, der RNA-Translation, Replikation und Virus-Assembly beurteilen, nutzten wir einen humanen Leberzellen (Huh-7 Zellen Lunet N 9), die endogene Expression von CD81 fehlt, ein wesentlicher Faktor der HCV-Eintrag. In Abwesenheit von CD81 ektopisch exprimiert, sind diese Zellen im Wesentlichen refraktär HCV-Infektion 10. Wichtig ist, wenn co-kultiviert und verschmolzen mit menschlichen Zellen, die CD81, aber Mangel mindestens ein weiterer entscheidender Faktor Eindringen in die Zelle (dh SR-BI, CLDN1, OCLN) zum Ausdruck bringen, zeigen nur die daraus resultierenden Heterokaryons den kompletten Satz von HCV-Eintrag Faktoren Voraussetzung für die Infektion. Daher, zu analysieren, ob beherrschenden Restriktionsfaktoren unterdrücken Vollendung des HCV-Replikationszyklus fusionierten wir Lunet N Zellen mit verschiedenen Zellen aus Mensch und Maus Ursprungs, das die oben genannten crit zu erfülleneria. Wenn co-kultivierten Zellen mit einem sehr fusogenen viralen Hüllprotein Mutante des Prototyps Foamyvirus (PFV 11) transfiziert wurden und anschließend mit infektiösen HCV-Partikel (die getesteten) herausgefordert wurde de novo Produktion von infektiösem Virus beobachtet. Dies zeigt, dass HCV erfolgreich seine Replikationszyklus in Heterokaryons so dass kein Expression von dominant Restriktionsfaktoren in diesen Zelllinien. Diese neuen bedingten trans-Komplementierung Methoden nützlich sein, einen großen Panel von Zelllinien und primäre Zellen zur Expression von HCV-spezifischen beherrschenden Restriktionsfaktoren zu screenen.
Protocol
Discussion
Es werden zwei Verfahren zur Bildung Heterokaryon in kultivierten Zellen für die Analyse von dominant-negativen Einschränkungen, die HCV-Replikation entgegen zu induzieren. Mit diesen Verfahren haben wir das Vorhandensein einer dominanten konstitutiv exprimiert oder Virus-induzierte Faktor in verschiedenen humanen nicht-Leber und in Mäuseleber Zelllinien ausgeschlossen. Der erste Test in erster Linie analysiert, wenn Restriktionsfaktoren verhindern HCV Zusammenbau und die Freisetzung von infektiösen Nachkommen. Da i…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Takaji Wakita und Jens Bukh für JFH1 und J6CF Virusisolate wurde beobachtet. Weiterhin danken wir Charles Rice für Huh-7.5-Zellen und die Antikörper 9E10, Steven Foung für die E2-spezifischen Antikörper CBH-23, und alle Mitglieder der Abteilung für Experimentelle Virologie, Twincore für hilfreiche Anregungen und Diskussionen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | |
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | |
| DAPI (4′,6′- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 |
| Alexa-Fluor 546 – goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 |
| Alexa-Fluor 488 – goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | |
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
Referenzen
- Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).
- Kato, T. Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon. J. Virol. 79, 592-596 (2005).
- Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line. J. Virol. 78, 491-501 (2004).
- Date, T. Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells. J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).
- Chang, K. S. Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities. J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).
- Zhong, J. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).
- Lindenbach, B. D. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309, 623-626 (2005).
- Wakita, T. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat. Med. 11, 791-796 (2005).
- Witteveldt, J. CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells. J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).
- Bitzegeio, J. Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).
- Lindemann, D., Goepfert, P. A. The foamy virus envelope glycoproteins. Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).
- Brohm, C. Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation. J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).
- Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles. J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).
- Koutsoudakis, G. Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses. J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).
- Frentzen, A. Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines. PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).
- Lindemann, D. A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity. J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).
- Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).
