Deux méthodes de formation hétérocaryons à découvrir les facteurs de restriction du VHC
Summary
Nous décrivons deux méthodes pour conditionnelle<em> Trans</em>-Complémentation de l'hépatite C (VHC) de montage et la réalisation du cycle de vie virale complète, qui reposent sur la formation des hétérocaryons. Ces techniques sont adaptées à l'écran pour les lignées cellulaires qui expriment des facteurs de restriction dominantes, qui empêchent la production de la descendance du VHC infectieux.
Abstract
L'hépatite C (VHC) est un virus hépatotrope avec une gamme d'hôtes limitée pour les humains et les chimpanzés. Bien que l'ARN du VHC de réplication a été observée dans les lignées cellulaires humaines non-hépatiques et murin, l'efficacité était très faible et les procédures de sélection requis à long terme en utilisant le VHC réplicon construit exprimant dominantes antibiotiques sélectionnables marqueurs 1-5. VHC in vitro de la recherche se limite donc à des lignées cellulaires d'hépatome permissives pour l'entrée du virus et l'achèvement du cycle de vie virale. En raison de HVC tropisme espèces étroit, il n'ya pas de modèle animal immunocompétent petite disponibles qui soutient le cycle de réplication du VHC complète 6-8. La réplication du VHC dans inefficace des cellules non humaines, par exemple d'origine de la souris est probablement dû à un manque d'incompatibilité génétique des facteurs essentiels de dépendance d'accueil et / ou l'expression de facteurs de restriction.
Nous avons étudié si la propagation du VHC est supprimée par fa restriction dominantectors en soit des lignées cellulaires humaines dérivées de non-hépatiques tissus ou dans des lignées de souris cellules hépatiques. À cette fin, nous avons développé deux indépendants conditionnelles trans-complémentation des méthodes reposant sur la fusion de cellules somatiques. Dans les deux cas, l'achèvement du cycle de réplication virale n'est possible que dans les hétérocaryons. Par conséquent, le succès trans-complémentation, qui est déterminée en mesurant la production de novo de la descendance virale infectieuse, indique l'absence de restrictions dominantes.
Plus précisément, subgénomiques réplicons du VHC portant un transgène luciférase ont été transfectés dans des cellules permissives hautement hépatome humain (Huh-7.5 des cellules). Par la suite, ces cellules ont été co-cultivées et fusionné à diverses cellules humaines et murines exprimant VHC noyau structurel protéines, de l'enveloppe 1 et 2 (E1, E2) et accessoire protéines p7 et NS2. À condition que la fusion cellulaire a été initiée par un traitement avec du polyéthylène-glycol (PEG), la culture virale infectieuse libérée particles qui a infecté des cellules naïves d'une manière dépendante du récepteur.
Pour évaluer l'influence des restrictions dominantes sur le cycle de vie complet, y compris virale entrée dans la cellule, la traduction d'ARN, la réplication et l'assemblage du virus, nous avons profité d'une lignée cellulaire de foie humain (Huh-7 Lunet N cellules 9) qui manque de l'expression endogène de CD81, un facteur essentiel de l'entrée du VHC. En l'absence de CD81 exprimés de manière ectopique, ces cellules sont essentiellement réfractaire à l'infection par le VHC 10. Il est important, en cas de co-culture et fusionnées avec des cellules qui expriment CD81 humain, mais le manque au moins un autre facteur crucial entrée dans la cellule (c.-à-SR-BI, CLDN1, OCLN), seuls les hétérocaryons résultant d'afficher l'ensemble des facteurs d'entrée du VHC nécessaires pour l'infection. Par conséquent, pour analyser si les facteurs de restriction dominantes supprimer l'achèvement du cycle de réplication du VHC, on condensé Lunet N cellules avec des cellules d'origine humaine différents et une souris qui remplissent la critique mentionnée ci-dessuseria. Lorsque des cellules co-cultivées ont été transfectées avec une protéine d'enveloppe virale hautement fusogène mutante de type foamy virus du prototype (PFV 11) et par la suite avec des particules de VHC défi infectieuses HCVcc), de novo de production de virus infectieux a été observée. Cela indique que le VHC complété avec succès son cycle de réplication dans les hétérocaryons écartant ainsi l'expression de facteurs de restriction dominantes dans ces lignées cellulaires. Ces nouveaux conditionnelles trans-complémentation méthodes sera utile pour dépister un large panel de lignées cellulaires et cellules primaires pour l'expression du VHC-spécifiques facteurs de restriction dominantes.
Protocol
Discussion
Nous présentons deux méthodes pour induire la formation hétérocaryon dans des cellules cultivées pour l'analyse des dominantes restrictions négatives qui empêchent la réplication du VHC. Utilisation ces procédures on exclut la présence d'un élément dominant exprimé de manière constitutive ou induit par un virus dans différentes humaine non foie et dans des lignées cellulaires hépatiques de souris. Le premier essai analyse principalement si les facteurs de restriction de prévenir assemblage du V…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Takaji Wakita et Jens Bukh pour JFH1 et les isolats de J6CF, respectivement. En outre, nous remercions Charles Rice pour Huh-7.5 des cellules et l'anticorps 9E10, Steven Foung pour l'anticorps spécifique à E2 CBH-23, et tous les membres du ministère de la virologie expérimentale, Twincore des suggestions utiles et des discussions.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | |
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | |
| DAPI (4′,6′- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 |
| Alexa-Fluor 546 – goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 |
| Alexa-Fluor 488 – goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | |
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
Referenzen
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