Summary

γHV68感染小鼠的测量

Published: November 22, 2011
doi:

Summary

γ-疱疹病毒(γ- HVS)在其主机建立终身续保。感染小鼠γ- HV68提供了一种基因听话<em>在体内</em>模型为表征的生命周期/γHVs发病机制。这个协议描述γHV68感染的检测和定量菌斑形成,传染病中心,qPCR实验感染后的急性和潜伏阶段。

Abstract

γ-疱疹病毒(γ- HVS)为显着的能力,建立潜伏感染的淋巴细胞1。人类γ- HVS,如EBV和KSHV的宿主范围狭窄,严重阻碍了详细的致病性研究。小鼠γ-疱疹病毒68(γHV68)股广泛的遗传和生物与人类的γ- HVS, 相似之处是2 murid啮齿动物的天然病原体。因此,γHV68感染小鼠近交系的评价,在病毒感染的不同阶段提供了一个认识过程中γ- HVS感染病毒的生命周期和发病机制的重要模式。

鼻内接种后,γHV68肺感染的急性血症结果,就是后来成隐性感染者脾细胞及其他细胞,这可能是整个生活的主机3,4恢复解决。在这个协议中,我们将描述如何使用斑块的检测,以评估在传染性病毒滴度肺组织匀浆后滴鼻感染(DPI)在早期阶段(5 – 7天)在Vero细胞单层。虽然急性感染主要是清除2 – 3周,隐性感染的γHV68各地建立了14 DPI,以后维持在小鼠的脾。隐性感染者通常会影响在受感染的组织细胞的一个非常小的人口,据此病毒保持休眠状态,并关闭其大部分基因的表达。潜伏感染的脾细胞自发激活后病毒组织培养,可以通过扼要传染病中心(IC)检测,以确定病毒潜伏负荷explanting。要进一步病毒基因组副本的数量估计在急性和/或潜伏感染的组织,实时定量PCR(定量PCR)用于其最大的灵敏度和准确性。的qPCR和斑块的检测和/或IC检测的结果结合起来分析,就会发现病毒的时空分布在体内的复制和传染性。

Protocol

下面的协议,将描述研究的病毒滴度和病毒基因组的γHV68溶骨性和潜伏性感染周期,在小鼠中,理论上可以用于评估感染其他病毒,分享相​​似的生活方式γHV68负载。 1。扩增的γHV68 在37℃水浴解冻γHV68冷冻小瓶。 将病毒接种到NIH3T12或3T3细胞培养(〜50%汇合)在10厘米的菜肴和文化感染的细胞在37℃,5%的CO 2。 检查显微镜细胞病变效应(CPE?…

Discussion

γHV68已被广泛用于作为一种模式来理解人类γ- HVS 2,4,5的发病机制。在这个协议中,我们描述了三个经常使用的方法,包括斑块传染性病毒滴度的检测,IC病毒潜伏负载检测,病毒基因组负载的qPCR,以评估后,在小鼠滴鼻接种γHV68急性和隐性感染者。

斑块的检测已广泛使用,以确定受感染的细胞或组织中的病毒滴度,但不同的病毒正在使用的最佳条件。这主要是因为?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者要感谢任孙(美国加州大学洛杉矶分校)和Seungmin黄某(华盛顿大学)的技术咨询和支持。这项工作是由巴克斯特基金会,国家卫生赠款研究院(R01 CA140964和R21 AI083841 C.梁)。

Materials

Material Name Preparation Procedure
Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay
  1. Heat ~ 250 ml of distilled water in TC bottle to > 80°C (boiling for 3 min in microwave)
  2. Add gradually 2.5 g MC powder into heated water, stirring over low heat until dissolved.
  3. Autoclave immediately for 15 min at liquid cycle.
  4. Stirring the autoclaved MC media at 4°C overnight.
  5. Combine 250 ml MC media with 200ml 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml FBS to give 500 ml overlay media.
Fix/stain medium for plaque assay 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol.
ACK Lysis Buffer NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM
Complete DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL).

Table 1. Specific media used in this protocol

Name of the reagent Company Catalogue number
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Xylazine Sigma-Aldrich X1251
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0512-250g
2 x MEM Life Technologies 11935
Cell strainer BD Faclon 352340
Omni tissue homogenizer OMNI International TH115
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
iQTM SYBRH Green Supermix BioRad 170-8882
CFX96 real-time PCR system Bio-Rad 184-5072
Cell counter Bio-Rad 145-0001
Sorvall SA-600 Thermo Scientific 096-124022

Table 2. Specific reagents and equipment

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Pirooz, S. D., Lee, J., Zhao, Z., Ni, D., Oh, S., Liang, C. Measurement of γHV68 Infection in Mice. J. Vis. Exp. (57), e3472, doi:10.3791/3472 (2011).

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