マウスにおけるγHV68感染の測定
Summary
γ-ヘルペスウイルス（γ- HVS）生涯その宿主に持続性を確立する。 γ- HV68とマウスの感染症は、遺伝的に扱いやすいが用意されています<em> in vivoで</emγHVsのライフサイクル/病因の特性評価のための>モデル。このプロトコルは、プラーク形成、感染症センター、およびqPCRアッセイによる感染後の急性および潜在的な段階でγHV68感染の検出および定量を説明します。
Abstract
γ-ヘルペスウイルスは、（γ- HVS）リンパ系細胞1の潜伏感染を確立する能力が特徴です。このようなEBVとKSHVとしてヒトγ-ハイブリッド自動車、の狭い宿主範囲は、深刻な詳細な病原性の研究を妨げている。マウスγ-ヘルペスウイルス68（γHV68）株のヒトγ-ハイブリッド自動車との広範な遺伝学的および生物学的な類似点とネズミ科齧歯類2の自然病原体です。このように、ウイルス感染のさまざまな段階でマウスのγHV68感染近交系の評価は、γ-ハイブリッド自動車の感染時にウイルスのライフサイクルと病因を理解するための重要なモデルが用意されています。
鼻腔内接種すると、肺の急性ウイルス血症のγHV68感染の結果は、後に脾細胞とホスト3,4のライフサイクル全体で再活性化することができる他の細胞、の潜伏感染に解決されている。このプロトコルでは、私たちはロバにプラークアッセイを使用する方法について説明します後鼻腔内感染（解像度）の – 早期（7日間5）でのベロ細胞単層上肺ホモジネート中の感染性ウイルスの力価。急性感染症は、主に2クリアされている間 – 3週間の感染後、γHV68の潜伏感染を14解像度の周りに確立され、後にマウスの脾臓の上に維持される。潜伏感染は通常、ウイルスが休眠状態にとどまり、その遺伝子発現のほとんどを遮断することにより、感染組織中の細胞の非常に小さな人口に影響を与えます。潜伏感染した脾細胞は、自発的にウイルスの潜在的な負荷を決定するために感染症センター（IC）アッセイによりrecapitulatedできる組織培養、にexplantingによってウイルスを再アクティブ化します。さらに急性および/または潜在的に感染した組織を、定量的リアルタイムPCRでウイルスゲノムのコピーの量を推定する（定量PCR）、その最大の感度と精度のために使用されます。定量PCRおよびプラークアッセイ、および/またはICアッセイの結果を組み合わせた解析は、ウイルス性の時空間プロファイルを明らかにする生体内での複製と感染。
Protocol
Discussion
γHV68は広くヒトγ-ハイブリッド自動車2,4,5の病因を理解するモデルとして使用されています。このプロトコルでは、我々はマウスの鼻腔内接種後γHV68の急性および潜伏感染を評価するために、感染性ウイルスの力価のためのプラークアッセイ、ウイルスの潜在的な負荷のためのICアッセイ、およびウイルスゲノムの負荷の定量PCRを含む3つの日常的に使用される方法を、説明した。
…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、漣サン（カリフォルニア大学、ロサンゼルス）とSeungmin黄（ワシントン大学）から技術的なアドバイスとサポートに感謝します。この作品は、バクスター財団、健康補助金の国立研究所（C.梁にR01 CA140964とR21 AI083841）によって賄われていた。
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
Referenzen
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