Misura della γHV68 infezione nei topi
Summary
Herpesvirus-γ (γ-HVS) stabilisce per tutta la vita persistenza nel loro ospite. L'infezione di topi con γ-HV68 offre una geneticamente trattabili<em> In vivo</emModello> per la caratterizzazione del ciclo di vita / patogenesi della γHVs. Questo protocollo descrive l'individuazione e quantificazione dei γHV68 infezione in fase acuta e latente dopo l'infezione con formazione di placca, centro infettive, e saggi qPCR.
Abstract
Herpesvirus-γ (γ-HVS) si distinguono per la loro capacità di stabilire infezioni latenti di cellule linfoidi 1. La gamma ristretta di ospitare umano γ-HVS, come EBV e KSHV, ha gravemente ostacolato studi dettagliati patogeni. Murino γ-herpesvirus 68 (γHV68) azioni estese somiglianze genetiche e biologiche umane con γ-HVS ed è un patogeno naturale di roditori murid 2. Come tale, la valutazione di γHV68 infezione ceppi di topi inbred a diversi stadi di infezione virale fornisce un modello importante per la comprensione del ciclo di vita virale e la patogenesi durante γ-HVS infezione.
Su inoculazione intranasale, γHV68 risultati infezione in viremia acuta nel polmone, che è poi risolto in una infezione latente di splenociti e di altre cellule, che può essere riattivato per tutta la vita dell'ospite 3,4. In questo protocollo, descriveremo come utilizzare il test per valutare la placcatitolo s virus infettivo nel polmone omogenati su monostrati di cellule Vero in fase precoce (5 – 7 giorni) di post-infezione intranasale (dpi). Mentre l'infezione acuta è in gran parte cancellato 2-3 postinfection settimane, una infezione latente di γHV68 è stabilito circa 14 dpi e mantenuto in seguito nella milza dei topi. Infezione latente di solito colpisce una popolazione molto piccola di cellule nei tessuti infetti, per cui il virus rimane inattivo e si spegne la maggior parte della sua espressione genica. Splenociti latentemente infette spontaneamente riattivare virus su espianto in colture di tessuti, che può essere riassunta da un centro infettivi (IC) test per determinare la carica virale latente. Per ulteriori stimare la quantità di copie del genoma virale nel acuta e / o tessuti latentemente infette, quantitativa real-time PCR (qPCR) è usato per la sua massima sensibilità e precisione. L'analisi combinata dei risultati dei test qPCR e placca, e / o dosaggio IC rivelerà il profilo spazio-temporale del viralereplicazione e l'infettività in vivo.
Protocol
Discussion
γHV68 è stato ampiamente utilizzato come modello per comprendere la patogenesi delle risorse umane γ-HVS 2,4,5. In questo protocollo, abbiamo descritto tre metodi utilizzati di routine, compreso saggio di placca per titolo virali infettive, test IC per il carico virale latente, e qPCR per il carico del genoma virale, per valutare l'infezione acuta e latente di γHV68 dopo l'inoculazione intranasale nei topi.
Il dosaggio della placca è stato ampiamente utilizzato per de…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare per la consulenza tecnica e supporto da Ren Sole (University of California, Los Angeles) e Seungmin Hwang (Washington University). Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Baxter, National Institutes di borse di Salute (R01 e R21 CA140964 AI083841 a C. Liang).
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
Referenzen
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