Summary

Homme In Vitro comme outil de dépistage pour la reconnaissance d'un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

Published: July 22, 2011
doi:

Summary

Tregs sont suppresseurs puissants du système immunitaire. Il ya un manque de marqueurs de surface unique de les définir, par conséquent, les définitions des Treg sont principalement fonctionnelle. Nous décrivons ici une optimisation<em> In vitro</em> Test capable d'identifier déséquilibre immunitaire chez les sujets à risque de développer le DT1.

Abstract

Les cellules T régulatrices (Treg) sont des médiateurs essentiels de la tolérance immunitaire aux antigènes du soi. De plus, ils sont des régulateurs essentiels de la réponse immunitaire après une infection. Malgré les efforts pour identifier les marqueurs de surface unique sur Tregs, la seule caractéristique unique est leur capacité à supprimer la prolifération et la fonction des lymphocytes T effecteurs. Alors qu'il est clair que seuls les essais in vitro peuvent être utilisés pour évaluer la fonction Treg humains, cela devient problématique lorsque l'évaluation des résultats à partir des études transversales où les cellules saines et les cellules isolées de sujets atteints de maladies auto-immunes (comme diabète de type 1-DT1) doivent être comparés. Il ya une grande variabilité entre les laboratoires dans le nombre et le type de cellules T intervenant, la nature et la force de stimulation, Treg: ratios répondeur et le nombre et le type de cellules présentatrices d'antigènes (APC) utilisés en médecine humaine dans les tests in vitro de suppression. Cette variabilité rend la comparaison entre les études mesurant la fonction Treg difficile. Le champ Treg a besoin d'un test de suppression standardisé qui va bien travailler avec des sujets sains et ceux atteints de maladies auto-immunes. Nous avons élaboré une épreuve suppression in vitro qui montre que très peu la variabilité intra-essai dans la stimulation des cellules T isolées chez des volontaires sains par rapport aux sujets avec une destruction auto-immune sous-jacente du pancréas β-cellules. L'objectif principal de cette pièce est de décrire un essai in vitro de suppression humaine qui permet la comparaison entre les groupes de sujets différents. De plus, ce test a le potentiel pour délimiter une petite perte de fonction et d'anticiper nTreg d'autres pertes dans le futur, donc sujets identification qui pourraient bénéficier d'une thérapie immunomodulatrice préventives 1. Ci-dessous, nous fournir une description approfondie des différentes étapes de cette procédure. Nous espérons contribuer à la standardisation de l'analyse de suppression in vitro utilisé pour mesurer la fonction Treg. En outre, nous offrons ce test comme outil de reconnaître un état de déséquilibre début immunitaire et un biomarqueur potentiel fonctionnel pour DT1.

Protocol

1. Avant de mettre en place un test de suppression, on a besoin de perles robe tosylactivated avec des anti-CD3 humain (clone UCHT1, 1μg/ml concentration finale) pour la stimulation des cellules et par la suite vérifier si les perles sont efficacement revêtus par la création d'une prolifération in vitro de dosage à l'aide humaine Les cellules T Prenez 1ml de M-450 perles tosylactivated du flacon d'origine, lieu support magnétique et maintenez jusqu'à ce que toutes les…

Discussion

Comme la seule caractéristique unique de Tregs, fonction suppressive doit être testé de façon fiable et uniforme entre les sujets à différentes phases de développement de la maladie dans les mêmes et entre les différentes études. Nous vous proposons des détails sur le test de suppression développés dans notre laboratoire que notre contribution à la standardisation de ce dosage. Dans notre étude d'optimisation approfondie, nous avons déterminé que la stimulation des cellules T avec des anti-CD3 humai…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par Max McGee Centre national de recherche pour les jeunes Diabetesat Medical College of Wisconsin et l'enfance Institut de recherche du Wisconsin. Les bailleurs de fonds n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données et d'analyse, ou de la préparation du manuscrit.

Materials

Name of the reagent or instrument Company Catalogue number Comments (optional)
Ficoll-Paque PLUS Amersham Pharmacia Biotech 17-1440-03  
DPBS-1X Gibco 14190-144  
Trypan Blue Invitrogen 15250-061  
anti-CD4 microbeads Miltenyi 130-045-101  
Pre-separation filters Miltenyi 130-041-407  
LS column Miltenyi 130-042-401  
EDTA Invitrogen 15575-020  
BSA Sigma-Aldrich B4287  
Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) BD Pharmingen 557852  
Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) BD Pharmingen 555432  
Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) BD Pharmingen 555366  
Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) BD Pharmingen 555397  
Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) BD Pharmingen 555448  
Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) BD Pharmingen 554532  
Dynalbeads M-450 tosylactivated Invitrogen 140-13  
Anti-human CD3 Ancell 144-024  
Buffer1 Homemade   0.1M Na2B4O7 pH7.6
Buffer2 Homemade   PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4
Buffer3 Homemade   0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5
Complete RPMI media Homemade   RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate
[3H] thymidine Perkin Elmer NET027Z005MC  
human pooled AB serum Atlanta Biologicals S40110  
Multiscreen harvest plate Millipore MAHFC1H60  
Microscint 20 Perkin Elmer 6013621  

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Waukau, J., Woodliff, J., Glisic, S. Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance. J. Vis. Exp. (53), e3071, doi:10.3791/3071 (2011).

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