Summary

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Published: July 22, 2011
doi:

Summary

Tregs والمكثفات قوية من الجهاز المناعي. هناك عدم وجود علامات سطح فريدة لتعريف بهم ، وبالتالي ، تعريفات Tregs وظيفية في المقام الأول. نحن هنا تصف الأمثل<em> في المختبر</em> مقايسة قادرة على تحديد الخلل المناعي في المواد المعرضة للخطر لتطوير T1D.

Abstract

التنظيمية خلايا T (Tregs) هي الحاسمة وسطاء التسامح المناعي في تقرير المصير ، مستضدات. بالإضافة إلى ذلك ، هم المنظمين الحاسمة للاستجابة مناعية بعد العدوى. على الرغم من الجهود المبذولة لتحديد علامة فريدة من نوعها على سطح Tregs ، الميزة الفريدة فقط هو قدرتها على منع انتشار الأسلحة النووية وظيفة الخلايا التائية المستجيب. في حين أنه من الواضح أن المقايسات فقط في المختبر يمكن استخدامها في تقييم وظيفة Treg الإنسان ، وهذا يصبح مشكلة عند تقييم النتائج من دراسات مستعرضة فيها الخلايا السليمة والخلايا المعزولة من الموضوعات مع أمراض المناعة الذاتية (مثل مرض السكري نوع 1 – T1D) الحاجة ويمكن مقارنة. هناك تفاوت كبير بين المختبرات في عدد ونوع من الخلايا التائية المستجيب وطبيعة وقوة التحفيز ، Treg : نسب المستجيب وعدد ونوع من خلايا مولدة تقديم (APC) المستخدمة في قمع الإنسان في فحوصات المختبر. هذا التباين يجعل المقارنة بين الدراسات قياس وظيفة Treg صعبة. الحقل Treg يحتاج الى فحص قمع موحدة من شأنها أن تعمل بشكل جيد مع كل من الاشخاص الاصحاء والمصابين بأمراض المناعة الذاتية. طورنا في الفحص المختبري القمع الذي يظهر القليل جدا من داخل مقايسة التباين في تحفيز خلايا تي المعزولة من المتطوعين الأصحاء مقارنة مع الموضوعات الأساسية تدمير المناعة الذاتية للخلايا البنكرياس β. الهدف الرئيسي لهذه القطعة لوصف تجربة في المختبر قمع الإنسان أن يسمح بإجراء مقارنة بين مجموعات مختلفة الموضوع. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الاختبار لديه القدرة على رسم خسارة صغيرة في nTreg وظيفة وتوقع مزيد من الخسائر في المستقبل ، ومن ثم تحديد الموضوعات التي يمكن أن تستفيد من المعالجة المناعية الوقائية 1. أدناه ، ونحن نقدم وصف دقيق للخطوات التي ينطوي عليها هذا الإجراء. نأمل أن تسهم في توحيد في المختبر فحص قمع المستخدمة لقياس وظيفة Treg. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نقدم هذا الاختبار كأداة ليتعرف على الدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي والعلامات البيولوجية المحتملة وظيفية للT1D.

Protocol

1. قبل وضع مقايسة القمع ، واحد يحتاج إلى معطف الخرز tosylactivated المضادة للبشرية CD3 (استنساخ UCHT1 ، 1μg/ml تركيز النهائي) لتحفيز الخلية ، وبعد ذلك يتم التحقق مما اذا كانت مغلفة بكفاءة حبات من خلال إنشاء المختبر في فحص انتشار استخدام الإنسان الخلايا التائية <ol style=";text-align:right…

Discussion

والميزة الفريدة فقط لTregs ، يجب اختبار الوظيفة القمعية وموثوق بها بشكل موحد بين الموضوعات في مختلف مراحل تطور المرض داخل نفسه ، وبين الدراسات المختلفة. ونحن نقدم تفاصيل قمع مقايسة وضعت في مختبرنا ومساهمتنا في توحيد هذا الاختبار. في دراستنا التحسين واسعة ، ونحن مصممون …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة ماكجي ماكس المركز القومي للبحوث الطبية لكلية Diabetesat الأحداث ويسكونسن وطفولة معهد البحوث ويسكونسن. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها ، أو في الإعداد للمخطوطة.

Materials

Name of the reagent or instrument Company Catalogue number Comments (optional)
Ficoll-Paque PLUS Amersham Pharmacia Biotech 17-1440-03  
DPBS-1X Gibco 14190-144  
Trypan Blue Invitrogen 15250-061  
anti-CD4 microbeads Miltenyi 130-045-101  
Pre-separation filters Miltenyi 130-041-407  
LS column Miltenyi 130-042-401  
EDTA Invitrogen 15575-020  
BSA Sigma-Aldrich B4287  
Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) BD Pharmingen 557852  
Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) BD Pharmingen 555432  
Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) BD Pharmingen 555366  
Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) BD Pharmingen 555397  
Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) BD Pharmingen 555448  
Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) BD Pharmingen 554532  
Dynalbeads M-450 tosylactivated Invitrogen 140-13  
Anti-human CD3 Ancell 144-024  
Buffer1 Homemade   0.1M Na2B4O7 pH7.6
Buffer2 Homemade   PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4
Buffer3 Homemade   0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5
Complete RPMI media Homemade   RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate
[3H] thymidine Perkin Elmer NET027Z005MC  
human pooled AB serum Atlanta Biologicals S40110  
Multiscreen harvest plate Millipore MAHFC1H60  
Microscint 20 Perkin Elmer 6013621  

Referenzen

  1. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
  2. Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
  3. Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
  4. Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
  5. Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
  6. Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
  7. Major, J. L., Meade, T. J. B. i. o. r. e. s. p. o. n. s. i. v. e. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
  8. Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
  9. Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
  10. Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
  11. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
  12. Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
  13. Yoo, B., Pagel, . An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
  14. Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
  15. Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
  16. Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
  17. Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
  18. Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
  19. Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Waukau, J., Woodliff, J., Glisic, S. Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance. J. Vis. Exp. (53), e3071, doi:10.3791/3071 (2011).

View Video