Ekstraselüler matriksin sertliği kuvvetle yapışık hücrelerinin birden fazla davranışları etkiler. Matrix sertliği bir doku boyunca mekansal değişir ve çeşitli hastalık koşullarında değişiklik uğrar. Burada atomik kuvvet mikroskobu microindentation kullanarak fare akciğer dokusunun normal ve fibrotik sertliği mekansal farklılıklar karakterize etmek için yöntemler geliştirmek.
Matrix sertliği 1-3 yapışık hücrelerin büyüme, farklılaşma ve fonksiyon kuvvetle etkiler. Makro ölçekte doku ve organlar, insan vücudu içinde sertlik büyüklüğü 4 çeşitli siparişler kapsar. Daha az sertlik dokular içinde mekansal değişir nasıl bilinir ve sertlik değişikliklerin kapsamı ve mekansal ölçekte doku remodeling sonucu hastalık süreçleri nelerdir. Daha iyi anlamak matris sertlik değişiklikler, sağlık ve hastalık hücresel fizyoloji nasıl katkıda için, yerleşik hücreleri ile ilgili bir mekansal ölçekte elde edilen doku sertliği ölçümleri ihtiyaç vardır. Bu, akciğer, son derece uyumlu ve elastik doku matriks remodeling, astım, amfizem, hipertansiyon ve fibrozis gibi hastalıkların önemli bir özelliği olduğu için özellikle doğrudur. Yerleşik hücreleri ile ilgili bir mekansal ölçekte akciğer parankiminin yerel mekanik ortamı karakterize etmek için, biz doğrudan yerel atomik kuvvet mikroskobu (AFM) microindentation kullanarak taze fare akciğer dokusunun elastik özellikleri ölçmek için yöntemler geliştirdiler. AFM indentor, konsol ve girinti derinliği uygun seçeneği ile, bu yöntemler faz kontrast ve floresan görüntüleme ilgi bölge ile paralel olarak yerel doku kayma modülü ölçümleri izin verir. Doku şeritleri Sistematik örnekleme, kayma modülü yerel mekansal değişimler ortaya doku mekanik özelliklerini haritalar sağlar. Mekanik özellikleri ve altta yatan anatomik ve patolojik özellikler arasındaki korelasyon sertlik fibrozis matriks birikimi ile nasıl değişeceğini göstermektedir. Bu yöntemler yerel doku mekanik özelliklerini alan ve hastalığın ilerlemesi üzerinde nasıl değişiklik gösterdiğini ortaya çıkarmak için diğer yumuşak dokular ve hastalık süreçleri kadar uzatılabilir.
AFM microindentation ile akciğer dokusunun mekanik karakterizasyonu, doku sertliği microscale varyasyonları üzerinde benzersiz bir bakış açısı sağlayarak, benzeri görülmemiş uzaysal çözünürlük (Şekil 4). Kendi programını bir örnek olarak, normal ve fibrotik akciğer dokusunda şeritleri önceki makro ölçekli ölçümler fibrozis 11,12 ile elastance yaklaşık 2-3 kat artış gösterdi. Aksine, AFM microindentation ~ 30 kat artar, normal akciğer dokusu 10 gözlenen ortanca üzerinde kayma modülü sergileyen bazı bölgelerde doku sertleşmesi, çok lokalize olduğunu ortaya koymaktadır . Matris sertlik şimdi kritik hücre fonksiyonunu etkileyen Bilindiği gibi, bu yerel ölçümleri, akciğer hücrelerinin hücre kültürü çalışması biofidelity geliştirmek için paha biçilmez parametreleri sağlamak.
Birkaç pratik konular, akciğer dokusunun ince şeritler kullanımı ile ortaya çıkar. Altta yatan alveoller mimari doku profili aşağıdaki gibi şeritler yüzeyler, tamamen düz değildir. Numune yüzeyinden yüksekliği değişimi bu zorluğu aşmalarına yardımcı olmak için 15 mm daha küçüktür AFM sistemi girinti sırasında otomatik olarak Z-yönünde ipucu konumunu ayarlar. Ölçümler oda sıcaklığında değil, 37 ° C yapılır, bu yüzden onlar küçük olması bekleniyor buna rağmen bu sıcaklık değişimi neden mekanik özelliklerinde sapmalar, değerlendirilemez. Gözlenen mekanik özellikleri altta yatan alveoler duvar mimarisinin etkisi mevcut ışık mikroskobu kurulumu ile belirlemek zordur. Örneğin, alveol duvarları ile uyumlu veya duvar düzlemine enine yönde girintili anizotropi ve farklı mekanik özellikler sergiler belirlemek için arzu edilmektedir. Ancak, mevcut örneklerinin kalın ve görüntüleme sistemi dolayısıyla temas her noktada yerel alveoler duvar yönünü belirlemek için mümkün değildir, 3 boyutlu yeteneklere sahip değildir. Son olarak, ölçülen mekanik özellikleri hücresel bileşenlerinin etkisi tam olarak aydınlatılamamıştır kalır. Burada ayrıntılı yöntemleri, hiçbir çaba özellikle doku hücresel bileşenleri kaldırmak için yapılır. Ancak, hücrelerin yüzeyinde girinti için kullanılabilir mevcut doku hasat ve alveoller erişmek için doku kesme zorunluluğu bu yana geçen süre göz önüne alındığında uygulanabilir olması muhtemel. Hücreleri çıkarmak ya da matrisler canlı hücreleri ile yeniden doldurmanız ve doku sertliği ortaya çıkan değişiklikleri değerlendirmek Belirli deneyler garanti görünecektir.
Bu ölçümler için gerekli taze Sabitlenmemiş doku olduğundan, doku hasat ölçümü geçen süreyi en aza indirilebilir ve örnekleri, 4 ° C mekanik özelliklerinde değişiklikleri önlemek için saklanmalıdır. Doku şeritler yıkama veya minimum bozulma veya hasar oluşturulur ve böylece boyama sırasında konteynerler arasında transfer olduğu özellikle dikkat edilmelidir. Sıvı AFM uygulama için önemli bir adım, mümkün olduğunca düz doku kesim ve destekleyici lamel örnek hareketsiz. Varsa, bir vibratome ya da doku dilimleme makinesi gibi otomatik bir kesit makine son derece uniform kalınlıkta dilimlemek için kullanılabilir. AFM ölçümleri hemen önce, doku şeritler eklemek ve örnek sonunda lamelleri ayırmak olarak AFM ölçümleri için geçen süreyi en aza indirmek için önemlidir. Yararlı bir gözlem fişleri kapak ve küçük şeritler PBS içinde daha uzun süreler için yerinde kalması daha stabil bağlamak için büyük şeritler görünür.
AFM microindentation 5 mikron çapında küresel ucu ile bir standart 0,06 N / m konsol kullanarak 100 Pa 50 kPa (kayma modülü) için geniş bir aralığı kapsayan örnekleri karakterize. AFM, 0,6 ila 12 mm, 0,01 ila 0,58 N / m arasında değişen çap ve yay sabitleri piyasada bulunan (örneğin Novascan) ve genellikle 3 kullanılan arasında değişen küresel cam ipuçları probları; Bu aralık, farklı yay sabitleri problar kullanılarak açılabilir. 5 mikron küresel bir ucu, ucu ve doku arasındaki teorik temas alanı, 400-700 nm girinti (Şekil 1A) için 5-9 mikron 2. Küçük veya daha büyük ipuçları, uzaysal çözünürlüğü daha küçük veya daha büyük ölçeklerde sağlamak için kullanılabilir. Piramidal ipuçları da daha az temas alanları sağlamak ve böylece veri uydurma, bu uç geometrisi için daha karmaşık olmasına rağmen, haritalama, mekansal çözünürlükte artan AFM microindentation 13-16 kullanılır.
Bu yöntem çeşitli sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Akciğer geleneksel mekanik basınç-hacim analizi 17 ya da tüm akciğerlerin yumruk girinti 19,20 kullanarak örneğin, non-invaziv karakterize olmuştur. Hava-sıvı int kaybı yoluyla akciğer mimarisinin önemli yollarından değiştirmek Burada açıklanan biri olarak invaziv yöntemlernormalde hava dolu akciğer ve solunum kaslarının gevşemesi üzerine akciğer kısmi enflasyon korur öncesi stres kaybı var erface. Bu sınırlamalar, akciğer dokusunda şeritler 18 yapılan tüm ölçümlerde sık görülür . Özellikle, bununla birlikte, medyan sertlik dinlenme hacimleri 19,20 sağlam akciğerlere yumruk-girinti dayalı tahminlerden önemli ölçüde farklılık göstermemektedir parankimi normal akciğer dokusunun (kayma modülü ~ 0.5kPa) ölçülür. Akciğer dokusunda artan deformasyonla birlikte non-lineer sertleşme sergilemek bilinen olsa da, sıkı bir moda bu özellik burada istihdam yöntemleri ile mikro ölçekli aşağı devam olmadığını test etmek mümkün değildir. Hertz, model, örnek homojenlik varsayar. Ancak, akciğer parankiminin dahil olmak üzere birçok biyolojik maddeler, mekansal ölçekler azalan giderek daha heterojen. Young modülü, yani deforme katmanı veya bileşen göre girinti derinliğine bağlı değişimi gibi eserler örnek heterojen neden olabilir. Xy-düzlemi heterojenite biyomateryal Dimitriadis EK ve ark tarafından önerilen mikro bağlı olarak uygun bir küresel uç boyutu dikkatle seçerek sınırlı olabilir. 8. Bu malzeme nedeniyle Hertz modeli hatası tahmin ya da düzeltmek için çok daha zordur z-yönünde heterojenite. Azeloglu ve ark. Son zamanlarda ayrık gömülü kapanımlar 21 ile heterojen substrat elastik özelliklerini karakterize etmek için melez bir hesaplama modeli önerdi. Onların yeni bir teknik Hertz analiz sınırlamaları tamamen ortadan kaldırıp heterojen malzemeler dahil özelliklerini hesaplamak için potansiyel bir gelir sağlar.
Biyolojik materyaller genellikle zamana bağımlı viskoelastik davranışları görüntülemek Hertz model aynı zamanda, mutlak elastik davranış varsayar. Tam bir doku viskoelastik karakterizasyonu değişen kullanılan girinti hızları elde edilebilir. Önemlisi, normal ve fibrotik akciğer dokusunda önceki makro ölçekli mekanik test, akciğer dokusunun mekanik özellikleri zayıf frekans bağımlılığı ve tüm frekansları arasında normal ve fibrotik doku mekanik özellikleri arasındaki farklılıkların korunması gösteren 11 test . Bu bulgular, güçlü tek bir girinti hızı ile AFM kullanarak mekanik özellikleri ölçümü fibrozis eşlik doku mekanik özelliklerinde değişiklikler önemli bir yönünü yakalar öneririz.
Bu çalışmada kullanılan akciğer dokusu için 0,4 Poisson oranı makroskopik ölçüm 9. Ne yazık ki, Poisson oranı ve mikro ölçekli hastalığı koşul altında herhangi bir değişiklik, literatürde mevcut değildir. E, E / (1-υ 2) veya (1-υ 2) / πE alternatifler (elastik sabiti k gösterilir) olarak 22 AFM microindentation hesaplanır ve Poisson oranı bilinmiyor olabilir. En biyomalzemeler için Poisson oranı yüksek su içeriği nedeniyle 0,4 – 0,5 aralığında. 1 / (1-υ 2) faktörü 0.3-0.5 aralığı içinde, Poisson oranı makul farklılıklar rapor modülü sadece mütevazı etkiler, sadece 1,10-1,33 değişir. Normal doku fibrotik doku akrabası için rapor artış kayma modülü, Poisson oranı farklılıklar ile ilişkili hataları gözlenen mekanik özellikleri değişiklikleri küçük ima, büyüklüğü birkaç kat.
Kuvvet-deplasman veri analizi için kullanılabilir gerçek algoritma ve kod özel uygulama durumu ve kuvvet-deplasman eğrileri çeşitli topluluklar sonraki özellikleri tabidir. Daha sofistike bir analiz ilgi ise, bir iş Lin ve ark danışabilirler 23. Yazarlar, daha önce Hertz girinti veri modelleri uydurma otomatikleştirmek için çabalarını engellemiştir komplikasyonlar birçok üstesinden bir algoritma sinerjik stratejilerinin bir dizi derlenmiş.
Birçok diğer alanlarda daha da geliştirilmesi ve kullanılması için bu yöntem kullanılabilir. Bir antikor etiketleme olmadan alveol duvarlarını görselleştirme ilgi durumlarda, elastin ve kolajen yeşil spektrum autofluorescent sinyal görüntülenebilmekte. Öte yandan, ince doku kesitlerinde, 3D görüntüleme teknikleri ya da her ikisi kullanılarak daha iyi görüntüleme, mekanik özellikleri altında yatan mimari dokusu ilişkilendirmek için yeteneklerini geliştirmek. Mevcut yöntemlerden, kollajen ve laminin gibi ekstraselüler matriks bileşenleri boyama ve görselleştirme izin verirken, daha fazla çaba gösterilmesi, belirli hücre popülasyonlarının belirlenmesi ve bu tür popülasyonlarının çevresinde mekanik mikroçevrelerde karakterize hücre yüzey belirteçleri boyama hedef olabilir. Alternatively, doku işaretleyicileri veya hücre spesifik proteinlerin aynı hedefi takip soyundan floresan etiketli ifade farelerden alınan hasat olabilir. Son olarak, burada bozulmasina astım bozulmasina hipertansiyon damarları ve solunum yolları, akciğer, diğer anatomik özellikleri karakterize uygun görünür ayrıntılı yöntem. Göre, daha fazla geliştirme için potansiyel gelişimi ve bugünkü durumu hakkında AFM microindentation doku sertliği akciğer hastalığın ilerlemesi eşlik değişiklikler hakkında değerli bilgiler verim hazır görünüyor ve herhangi bir mekansal ve zamansal değişiklikler karakterize değeri şüphesiz diğer yumuşak dokularda çeşitli sertlik.
The authors have nothing to disclose.
Biz onların sürekli işbirliği için teşekkür eder, A. Tager ve B. Shea ve gösteri amaçlı kullanılan akciğer dokusunda sağlamak için burada. Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe HL-092.961 Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir. Bu çalışma, NSF ödül ECS-0335765 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen Nano Sistemleri (MSS), Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı üyesi Merkezi'nde yapıldı. MSS, Harvard Üniversitesi Sanat ve Sosyal Bilimler Fakültesi parçasıdır.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |