Die Steifigkeit der extrazellulären Matrix stark beeinflusst mehrere Verhalten von adhärenten Zellen. Matrix Steifigkeit variiert räumlich in einem Gewebe, und unterliegt Änderungen in verschiedenen Krankheitszuständen. Hier entwickeln wir Methoden, um räumliche Veränderungen der Steifigkeit in normalen und fibrotische Maus Lungengewebe mit Rasterkraftmikroskopie Mikroindentation charakterisieren.
Matrix Steifigkeit stark beeinflusst Wachstum, Differenzierung und Funktion von anhaftenden Zellen 1-3. Auf der Makroebene die Steifigkeit von Geweben und Organen im menschlichen Körper über mehrere Größenordnungen 4. Viel weniger ist über, wie Steifigkeit räumlich variiert innerhalb von Geweben bekannt, und was den Umfang und die räumliche Skala von Steifigkeit Änderungen sind in Krankheitsprozesse, die sich in Gewebe-Remodeling. Um besser zu verstehen, wie sich Änderungen in der Matrix Steifigkeit Zellphysiologie beitragen in Gesundheit und Krankheit, werden die Messungen von Gewebe Steifigkeit bei einer räumlichen Skala relevanten Wohnsitz erhaltenen Zellen benötigt. Dies gilt insbesondere für die Lunge, ein hoch-konform und elastischem Gewebe, in dem Matrix Remodelling ist ein hervorstechendes Merkmal in Krankheiten wie Asthma, Emphysem, Hypertonie und Fibrose. Zur Charakterisierung der lokalen mechanischen Umfeld des Lungenparenchyms mit einer räumlichen Skala relevanten residenten Zellen haben wir Methoden zur direkten Messung der lokalen elastischen Eigenschaften des frischen murine Lungengewebe mit Rasterkraftmikroskopie (AFM) Mikroindentation entwickelt. Bei entsprechender Wahl der AFM Eindringkörper, Freischwinger und Eindringtiefe, erlauben diese Methoden Messungen der lokalen Gewebe Schubmodul parallel mit Phasenkontrast-und Fluoreszenz-Imaging in der Region von Interesse. Systematische Entnahme von Gewebe-Streifen bietet Karten von Gewebe mechanische Eigenschaften, die lokale räumliche Variationen in Schubmodul offenbaren. Korrelationen zwischen mechanischen Eigenschaften und der zugrunde liegenden anatomischen und pathologischen Merkmale zeigen, wie Steifigkeit mit Matrix-Ablagerung in Fibrose variiert. Diese Methoden können in andere Weichteile und Krankheiten ausgedehnt werden, um zeigen, wie lokale Gewebe mechanische Eigenschaften über Raum und zum Fortschreiten der Krankheit variieren.
Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit AFM Mikroindentation bietet beispiellose räumliche Auflösung (Abb. 4) und bietet eine einzigartige Perspektive auf mikro-Variationen in Gewebesteifigkeit. Als ein Beispiel für seine Nützlichkeit, angegeben bisherigen Makro-Messungen in normaler und fibrotischen Lungengewebe Streifen eine ungefähre 2-3-fache Erhöhung der Elastance mit Fibrose 11,12. Im Gegensatz dazu zeigt AFM Mikroindentation dass Gewebe Versteifung ist klar lokalisiert und mit einigen Regionen ausstellenden bis ~ 30-fache Erhöhung der Schubmodul über dem Median in normalem Lungengewebe 10 beobachtet. Als Matrix Steifigkeit jetzt bekannt ist, entscheidend beeinflussen Zellfunktionen, bieten diese lokalen Messungen von unschätzbarem Wert Parameter an die biofidelity von Zellkultur-Studie der Lungenzellen zu verbessern.
Mehrere praktische Fragen ergeben sich durch die Verwendung von dünnen Streifen des Lungengewebes. Die Oberflächen der Bänder sind nicht perfekt flach, da das Gewebe Profil folgt die Architektur des zugrunde liegenden Alveolen. Die AFM-System passt sich automatisch Spitzenposition in der Z-Richtung während Einzug, wenn die Probenoberfläche Höhenvariation kleiner ist als 15-um zu helfen, die Herausforderung zu meistern. Die Messungen sind bei Raumtemperatur nicht 37 ° C aus, so Abweichungen der mechanischen Eigenschaften durch diese Temperaturschwankungen verursacht werden, können nicht ausgewertet werden, obwohl sie würden erwarten, dass kleinere werden. Der Einfluss der zugrunde liegenden Alveolenwand Architektur auf den beobachteten mechanischen Eigenschaften ist schwierig, mit den aktuellen Lichtmikroskopie Setup ermitteln. Zum Beispiel wäre es wünschenswert, um festzustellen, ob Alveolarwände Anisotropie und unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften aufweisen, wenn sie in Richtungen ausgerichtet oder quer zur Ebene der Wand eingedrückt. Allerdings sind die aktuellen Exemplare dick, und die Imaging-System keine 3D-Funktionen, daher ist es nicht möglich, die lokalen Alveolenwand Orientierung an jedem Punkt des Kontaktes zu bestimmen. Schließlich bleibt der Einfluss der zellulären Bestandteile am gemessenen mechanischen Eigenschaften nicht vollständig geklärt. In den Methoden detaillierte hier werden keine Anstrengungen unternommen, um gezielt zu entfernen zellulären Bestandteile des Gewebes. Allerdings stellen die Zellen an der Oberfläche zur Verfügung Eindrucks kaum lebensfähig zu sein angesichts der Zeit, da Gewebe Ernte und die Notwendigkeit des Schneidens des Gewebes um den Zugang zu den Alveolen zu gewinnen vergangen. Spezielle Experimente an Zellen zu entfernen oder neu zu besiedeln Matrizen mit lebenden Zellen, und bewerten die daraus resultierenden Veränderungen in Gewebesteifigkeit scheint gerechtfertigt.
Da frische unfixierten Gewebe für diese Messungen benötigt wird, sollte die Zeit von Gewebe Ernte der Messung vergangen minimiert und Proben sollten bei 4 ° C gelagert werden, um Veränderungen der mechanischen Eigenschaften zu vermeiden. Besonderes Augenmerk sollte, wenn Gewebe Streifen zwischen Containern beim Waschen oder Färben, so dass minimale Verformung oder Beschädigung erzeugten übertragen werden. Für AFM Anwendung in flüssiger, ist ein entscheidender Schritt, um das Gewebe so flach wie möglich schneiden und bewegungsunfähig die Probe auf die Unterstützung Deckglas. Falls vorhanden, kann eine automatisierte Schneiden Maschine wie ein Vibratom oder Gewebe Hobel verwendet, um Scheiben von sehr gleichmäßige Dicke geschnitten werden. Es ist wichtig, um Gewebe-Streifen sofort anschließen, bevor AFM-Messungen und zur Minimierung der Zeit für AFM-Messungen verstrichen, da die Probe wird schließlich aus der Deckgläser ablösen. Eine nützliche Beobachtung ist, dass größere Streifen zu befestigen stabiler zu rutscht abdecken und in Kraft bleiben für längere Laufzeiten in PBS als kleinere Streifen erscheinen.
AFM Mikroindentation können charakterisieren Proben umfassen ein breites Spektrum von 100 Pa bis 50 kPa (Schubmodul) bei Verwendung eines Standard 0,06 N / m Ausleger mit einem 5 Mikrometer Durchmesser kugelförmiger Spitze. Dieser Bereich lässt sich mittels Sonden mit unterschiedlichen Federkonstanten werden; AFM-Sonden mit kugelförmigen Glas-Tipps bis hin 0,6 bis 12 &mgr; m im Durchmesser und Federkonstanten zwischen 0,01 bis 0,58 N / m sind im Handel erhältlich (z. B. Novascan) und häufig gebrauchte 3. Mit einem 5 um kugelförmige Spitze, ist die theoretische Kontaktfläche zwischen Spitze und Gewebe etwa 5-9 um 2 für 400-700 nm Vertiefung (Abb. 1A). Kleinere oder größere Tipps können verwendet werden, um kleinere oder größere Schuppen von räumlicher Auflösung liefern. Pyramidal Tipps sind auch in AFM Mikroindentation 13-16 verwendet worden, die zumeist kleineren Kontaktflächen und somit zur Steigerung räumliche Auflösung bei der Kartierung, obwohl Daten Montage komplexer ist für diesen Tipp Geometrie.
Mehrere Einschränkungen dieser Methode zu beachten. Die Lunge ist traditionell mechanisch nicht-invasiv, zum Beispiel mit Druck-Volumen-Analyse 17 oder Punch-Einzug der ganzen Lunge 19,20 aus. Invasive Methoden wie das hier beschriebene Veränderung der Lunge Architektur in wichtigen Punkten durch den Verlust der Luft-Flüssigkeit-interface, die normalerweise existiert in der luftgefüllten Lunge und der Verlust der Vorspannung, die Lunge teilweise Inflation bleibt auf Entspannung der Atemmuskulatur. Diese Einschränkungen sind für alle Messungen im Lungengewebe Streifen 18 hergestellt. Bemerkenswert ist jedoch der Median Steifigkeit in das Parenchym von normalem Lungengewebe (Schubmodul ~ 0.5kPa) gemessen unterscheidet sich nicht wesentlich von Schätzungen, die auf Punch-Einzug der intakten Lunge in Ruhe Bänden 19,20 basieren. Während Lungengewebe ist bekannt, dass nicht-linearen Versteifung mit zunehmender Verformung aufweisen, ist es nicht möglich, in einem strengen Mode testen, ob diese Eigenschaft sich weiterhin auf die Mikro-Maßstab mit dem hier verwendeten Verfahren. Die Hertz-Modell geht Homogenität der Probe. Allerdings sind die meisten biologischen Materialien, einschließlich Lungenparenchym, zunehmend heterogenen bei sinkenden räumlichen Skalen. Die Heterogenität der Probe kann Artefakte wie Variation der Young-Modul je nach Eindringtiefe, dh je nach der Schicht oder Komponente, die Verformung führen. Die Heterogenität in der xy-Ebene können durch sorgfältige Auswahl der entsprechenden sphärischen Spitze Größe abhängig von der Mikrostruktur des Biomaterials durch Dimitriadis EK et al begrenzt werden. 8 Es ist viel schwieriger zu prognostizieren oder korrigieren Sie die Hertz-Modell Fehler aufgrund von Material Heterogenität in der z-Richtung. Azeloglu et al. vor kurzem vorgeschlagen, ein Hybrid-Rechenmodell, um die elastischen Eigenschaften von heterogenen Substrat mit diskreten eingebetteten Einschlüsse 21 charakterisieren. Ihre neue Technik bietet ein mögliches Mittel, um die Aufnahme Eigenschaften von heterogenen Materialien Überwindung der Beschränkungen des Hertzschen Analyse zu berechnen.
Die Hertz-Modell nimmt auch absolute elastische Verhalten, während biologische Materialien zeigen in der Regel zeitabhängige viskoelastische Verhalten. Eine vollständige viskoelastische Charakterisierung des Gewebes kann durch Variation der Einzug Geschwindigkeiten verwendet eingeholt werden. Wichtig ist, zeigt bisherigen Makro-mechanische Prüfung von Normal-und fibrotischen Lungengewebe schwache Frequenzabhängigkeit des Lungengewebes mechanischen Eigenschaften und die Bewahrung der Unterschiede zwischen normalen und Bindegewebe mechanischen Eigenschaften über alle Frequenzen getestet 11. Diese Befunde legen nahe, dass die Messung der mechanischen Eigenschaften mit einer einzigen Vertiefung Geschwindigkeit, mit AFM ein wesentlicher Aspekt der Veränderungen im Gewebe mechanische Eigenschaften, die Fibrose begleiten erfasst.
Die Poisson-Verhältnis von 0,4 für das Lungengewebe in dieser Arbeit verwendet wird, aus einer makroskopischen Messung 9. Leider sind die Poissonzahl auf Mikro-Ebene und Änderungen unter Krankheitszustand in der Literatur nicht zur Verfügung. Als Alternative zu E, E / (1-υ 2) oder (1-υ 2) / πE (die elastische Konstante k bezeichnet) 22 kann von AFM Mikroindentation berechnet und gemeldet werden, wenn die Poissonzahl unbekannt ist. Für die meisten Biomaterialien Poissonzahl ist im Bereich von 0,4 bis 0,5 aufgrund ihres hohen Wassergehaltes. Im Bereich von 0,3 bis 0,5 variiert der Faktor 1 / (1-υ 2) nur 1,10 bis 1,33, so dass zumutbare Abweichungen in der Poissonzahl nur bescheidene Auswirkungen auf die gemeldete Modul auszuüben. Der Anstieg der Schubmodul, dass wir Bericht für fibrotische Gewebe bezogen auf normales Gewebe ist mehrfach in Größe, was bedeutet, dass Fehler mit Variationen in Poissonzahl verbundenen geringen relativ zu den Veränderungen der mechanischen Eigenschaften beobachtet werden.
Der eigentliche Algorithmus und Code, der für die Analyse der Kraft-Weg-Daten verwendet werden kann, ist vorbehaltlich der spezifischen Anwendung Zustand und die anschließende Eigenschaften der verschiedenen Bevölkerungsgruppen des Kraft-Weg-Kurven. Wenn mehr ausgefeilte Analyse von Interesse ist, kann man bitte das Arbeitsprogramm der Lin et al. 23. Die Autoren stellten eine Reihe von synergistischen Strategien in einen Algorithmus, der viele der Komplikationen, die bisher die Bemühungen um den Einbau von Hertz-Modelle Einzug Daten automatisieren behindert haben überwindet.
Mehrere andere Bereiche sind für die weitere Entwicklung und Nutzung dieser Methode. In Fällen, wo man bei der Visualisierung der Alveolarwände ohne Antikörpermarkierung interessiert ist, kann sowohl Elastin und Kollagen visualisiert werden von ihren autofluoreszierenden Signal im grünen Spektrum. Auf der anderen Seite könnte eine bessere Bildgebung, entweder mit dünner Gewebeschnitte, 3D-Bildgebung, oder beides, verbessern die Fähigkeit, Gewebe-Architektur mit zugrunde liegenden mechanischen Eigenschaften korreliert. Während die aktuellen Methoden Färbung und Visualisierung von Komponenten der extrazellulären Matrix, wie Kollagen und Laminin ermöglichen, könnten zusätzliche Anstrengungen zur Färbung Zelloberflächenmarker auf bestimmte Zellpopulationen zu identifizieren und die mechanische Mikroumgebungen in der Nähe solcher Populationen zu charakterisieren angestrebt werden. Alternatively, konnte Gewebe von Mäusen, die Fluoreszenz-markierten Linie Marker oder Zelle bestimmte Proteine, die dasselbe Ziel verfolgen, geerntet werden. Schließlich detailliert die Methode scheint hier gut zu charakterisieren andere anatomische Merkmale in der Lunge, wie Schiffe, die Umgestaltung in Hypertonie und Atemwegen, die Umgestaltung in Asthmatiker geeignet. Auf der Grundlage seiner aktuellen Stand der Entwicklung und das Potenzial für eine weitere Verbesserung, erscheint AFM Mikroindentation balanciert, um wertvolle Einblicke in die Veränderungen im Gewebe Steifigkeit, die Progression der Erkrankung in der Lunge begleiten Ausbeute und wird ohne Zweifel von Wert bei der Charakterisierung von räumlichen und zeitlichen Veränderungen in der Steifigkeit einer Vielzahl anderer Weichteile.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken A. Tager und B. Shea für ihre kontinuierliche Zusammenarbeit und für die Bereitstellung des Lungengewebes zu Demonstrationszwecken verwendet hier. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren HL-092961 gefördert. Diese Arbeit wurde teilweise am Center for Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied der National Nanotechnology Infrastructure Network, das von der National Science Foundation NSF unter Auszeichnung ECS-0335765 wird unterstützt durchgeführt. CNS ist Teil der Faculty of Arts and Sciences der Harvard University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
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AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |