صلابة من المصفوفة خارج الخلية يؤثر بشدة السلوكيات متعددة من الخلايا الملتصقة. مصفوفة صلابة يختلف مكانيا في جميع أنحاء الأنسجة ، ويخضع لتعديل في الحالات المرضية المختلفة. نحن هنا لتطوير أساليب تميز الاختلافات المكانية في صلابة في الحالات العادية وتليفي الماوس أنسجة الرئة باستخدام المجهر الذري microindentation القوة.
مصفوفة الصلابة تؤثر تأثيرا قويا النمو ، والتمايز وظيفة الخلايا الملتصقة 1-3. على المستوى الكلي للتصلب الأنسجة والأعضاء داخل الجسم البشري تمتد عدة أوامر من حجم 4. لا يعرف الكثير الكثير عن كيفية تصلب الأنسجة يختلف مكانيا داخل ، وما هو نطاق وحجم التغيرات المكانية وصلابة في عمليات المرض التي تؤدي إلى إعادة تشكيل الأنسجة. إلى فهم أفضل لكيفية التغيرات في صلابة مصفوفة تسهم في الفيزيولوجيا الخلوية في الصحة والمرض ، وهناك حاجة إلى تصلب الأنسجة من القياسات التي تم الحصول عليها على نطاق والمكانية ذات الصلة على الخلايا المقيمين. هذا صحيح لا سيما بالنسبة لسرطان الرئة ، وأنسجة متوافقة للغاية ومرنة في إعادة تشكيل المصفوفة الذي هو سمة بارزة في أمراض مثل الربو ارتفاع ضغط الدم وانتفاخ الرئة والتليف. لتحديد خصائص البيئة المحلية الميكانيكية لحمة الرئة على نطاق والمكانية ذات الصلة على الخلايا المقيمين ، وقمنا بتطوير أساليب مباشرة لقياس الخصائص المحلية المرنة من الفئران الطازجة أنسجة الرئة باستخدام المجهر قوة نووية (فؤاد) microindentation. مع الاختيار المناسب للINDENTOR فؤاد ، ناتئ ، وعمق المسافة البادئة ، وهذه الأساليب تسمح القياسات المحلية معامل نسيج القص بالتوازي مع المرحلة وعلى النقيض من التصوير مضان المنطقة من الفائدة. أخذ عينات منتظمة من شرائط نسيج توفر خرائط لخصائص الأنسجة الميكانيكية التي تكشف الاختلافات المكانية المحلية في معامل القص. الارتباط بين الخواص الميكانيكية والكامنة الميزات التشريحية والمرضية لتوضيح كيفية صلابة يختلف مع ترسب مصفوفة في التليف. ويمكن تمديد هذه الأساليب إلى الأنسجة اللينة والعمليات الأخرى للكشف عن المرض كيف الخصائص الميكانيكية النسيج المحلية تختلف باختلاف المكان وتطور المرض.
توصيف الميكانيكية للأنسجة الرئة باستخدام فؤاد microindentation عروض لم يسبق لها مثيل القرار المكانية (الشكل 4) ، وتقديم منظور فريد على الاختلافات في تصلب الأنسجة الميكروسكيل. كمثال على فائدتها ، وأشار السابقة الماكرو النطاق العادي والقياسات في تليفي شرائح أنسجة الرئة تقريبي 2-3 أضعاف الزيادة في مرانية مع التليف 11،12. في المقابل ، يكشف عن أن فؤاد microindentation تشنج الأنسجة المترجمة للغاية ، مع اظهار بعض المناطق تصل إلى ~ يزيد 30 أضعاف في معامل القص فوق المتوسط التي لوحظت في أنسجة الرئة العادية 10. كما هو معروف الآن صلابة مصفوفة للتأثير حاسم وظيفة الخلية ، وهذه القياسات المحلية توفير معلمات لا تقدر بثمن لتعزيز biofidelity دراسة ثقافة خلية من خلايا الرئة.
قضايا عملية عديدة تنشأ مع استخدام شرائح رقيقة من نسيج الرئة. السطوح من شرائط ليست مسطحة تماما ، كما يلي ملف الأنسجة بنية الحويصلات الكامنة. نظام AFM تلقائيا بضبط موقف طرف في Z – الاتجاه خلال البادئة عند ارتفاع سطح التباين عينة أصغر من 15 ميكرومتر للمساعدة في التغلب على هذا التحدي. يتم إجراء قياسات في درجة حرارة الغرفة ، وليس 37 درجة مئوية ، لذلك لا يمكن أن الانحرافات في الخواص الميكانيكية الناجمة عن هذا الاختلاف في درجات الحرارة يمكن تقييمها ، بالرغم من أنه سيكون من المتوقع أن تكون طفيفة. تأثير العمارة الجدار السنخي الكامنة على الخواص الميكانيكية لوحظ من الصعب تحديد الإعداد مع ضوء الفحص المجهري الحالي. على سبيل المثال ، سيكون من المرغوب فيه لتحديد ما إذا الجدران السنخية معرض تباين الخواص الميكانيكية ومختلفة عند بادئة في اتجاهات تتماشى مع أو عرضية لطائرة من الجدار. ومع ذلك ، فإن العينات الحالية هي سميكة ونظام التصوير لا يملك قدرات 3D ، وبالتالي فمن غير الممكن لتحديد اتجاه الجدار السنخي المحلية في كل نقطة اتصال. أخيرا ، فإن تأثير الناخبين الخليوي في قياس الخصائص الميكانيكية لا يزال يتعين توضيحها بشكل كامل. في أساليب مفصلة هنا ، لم تبذل جهود لإزالة المكونات الخلوية تحديدا من الأنسجة. ومع ذلك ، فإن الخلايا موجودة على سطح متاح المسافة البادئة من غير المحتمل أن تكون مجدية بالنظر إلى الوقت الذي انقضى منذ الحصاد الأنسجة وضرورة قطع الأنسجة للوصول إلى الحويصلات الهوائية. وتجارب محددة لإزالة الخلايا ، أو اعد اسكان المصفوفات مع خلايا قابلة للحياة ، وتقييم التغيرات الناتجة في تصلب الأنسجة تظهر يبرره.
لأن هناك حاجة الأنسجة غير المثبتة جديدة لهذه القياسات ، ينبغي التقليل من الوقت الذي انقضى من محصول الأنسجة لقياس ويجب أن يتم تخزين العينات في 4 درجات مئوية لتفادي تغيرات في الخصائص الميكانيكية. وينبغي إيلاء اهتمام خاص عندما يتم نقل الحاويات بين شرائح النسيج خلال غسلها أو تلطيخ بحيث يتم إنشاء الحد الأدنى من التشويه أو أضرار. للتطبيق في AFM السائل ، هو خطوة حاسمة لقطع الانسجة كما شقة ممكن ، ويستوقف العينة على دعم ساترة. إذا كانت متوفرة ، ويمكن استخدام جهاز الآلي sectioning مثل تقطيع اللحم والأنسجة vibratome أو لقطع شرائح من سمك موحد للغاية. من المهم أن نولي شرائح الأنسجة مباشرة قبل قياسات AFM وتقليل الوقت المنقضي لقياسات AFM كما العينة سيتم فصل في نهاية المطاف من coverslips. من المفيد الملاحظة هو أن أكبر شرائح يبدو أن نعلق أكثر ثابت لتغطية زلات وتبقى في مكانها لفترات أطول في برنامج تلفزيوني من أصغر شرائح.
يمكن فؤاد microindentation تميز عينات تغطي مجموعة واسعة من 100 الى 50 كيلو باسكال (معامل القص) عند استخدام معيار 0.06 غ / م ناتئ مع طرف قطره 5 ميكرومتر كروية. ويمكن توسيع هذا النطاق باستخدام المسابر مع ثوابت الربيع مختلفة ؛ تحقيقات فؤاد مع نصائح الزجاج كروية تتراوح 0،6 حتي 12 ميكرون في القطر ، والثوابت الربيع تتراوح 0،01-0،58 نيوتن / متر متوفرة تجاريا (مثل Novascan) وتستخدم عادة 3. مع تلميح كروية 5 ميكرون ، ومنطقة التماس بين النظرية والأنسجة غيض حوالي 5-9 ميكرون 2 للتسنن 400-700 نانومتر (الشكل 1A). ويمكن استخدام نصائح أصغر أو أكبر لتقديم جداول أصغر أو أكبر من القرار المكانية. كما تم استخدامها في الهرمية نصائح microindentation فؤاد 13-16 ، توفير مساحات أصغر ، وبالتالي زيادة الاتصال المكاني القرار في رسم الخرائط ، وعلى الرغم من البيانات المناسب هو أكثر تعقيدا لهذه الهندسة الحافة.
وتجدر الإشارة إلى العديد من القيود على هذا الأسلوب. وقد جرت العادة في الرئة تميزت ميكانيكيا غير جراحية ، على سبيل المثال باستخدام الضغط تحليل حجم 17 أو لكمة المسافة البادئة في الرئتين كله 19،20. طرق الغازية مثل تلك الموصوفة هنا تغيير بنية الرئة في الطرق الهامة من خلال فقدان كثافة الهواء السائلerface موجود بشكل طبيعي في الرئة مليئة بالهواء وفقدان التوتر قبل أن يحافظ على معدل التضخم عند جزئية الرئة استرخاء عضلات الجهاز التنفسي. هذه القيود هي مشتركة بين جميع القياسات التي أجريت في 18 شرائح أنسجة الرئة. على وجه الخصوص ، ومع ذلك ، فإن صلابة الوسيط يقاس في لحمة النسيج رئة طبيعية (معامل القص ~ 0.5kPa) لا يختلف كثيرا عن التقديرات على أساس المسافة البادئة لكمة من الرئتين سليمة في حجم راحة 19،20. بينما هو معروف أنسجة الرئة يحمل غير الخطية تشنج مع زيادة التشوه ، لم يكن ممكنا لاختبار على نحو دقيق ما إذا استمرت هذه الخاصية وصولا الى النطاق الجزئي مع الأساليب المستخدمة هنا. نموذج هيرتز يفترض تجانس العينة. ومع ذلك ، معظم المواد البيولوجية ، بما فيها لحمة الرئة ، وغير متجانسة بشكل متزايد على خفض مستويات مكانية. يمكن عدم تجانس العينة نتيجة في مثل التحف تباين في معامل يونغ اعتمادا على عمق المسافة البادئة ، اعتمادا على أي طبقة أو المكون الذي هو تشويه. ويمكن أن يقتصر على عدم التجانس في الطائرة – XY باختيار دقيق لحجم المناسبة غيض كروية اعتمادا على البنية المجهرية للمادة بيولوجية كما اقترح آخرون Dimitriadis بن EK 8 وهو أكثر من الصعب التنبؤ أو تصحيح الخطأ نموذج هيرتز بسبب المواد عدم التجانس في الاتجاه التصاعدي. Azeloglu وآخرون. اقترحت مؤخرا نموذج هجين الحسابية لتوصيف خصائص المرونة من الركيزة غير المتجانسة مع منفصلة جزءا لا يتجزأ من شوائب 21. التقنية الجديدة توفر الوسائل المحتملة لحساب خصائص ادراج مواد غير متجانسة التغلب على القيود المفروضة على تحليل الهرتزية.
نموذج هيرتز يفترض أيضا مرونة السلوك المطلق ، في حين عرض المواد البيولوجية عادة السلوكيات اللزجة التي تعتمد على الوقت. ويمكن الحصول على توصيف كامل اللزجة من الأنسجة من خلال تغيير السرعات البادئة المستخدمة. اختبار الأهم من ذلك ، السابقة الماكرو النطاق للفحص الميكانيكي للأنسجة الرئة الطبيعية وضعف الاعتماد تليفي يوضح تواتر الخصائص الميكانيكية أنسجة الرئة ، والحفاظ على الفوارق بين الأنسجة الطبيعية والخصائص الميكانيكية تليفي جميع الترددات 11. هذه النتائج تشير بقوة إلى أن قياس الخواص الميكانيكية باستخدام السرعة المسافة البادئة واحد مع فؤاد يجسد جانبا أساسيا من التغييرات في خصائص ميكانيكية الأنسجة التي تصاحب التليف.
النسبة من 0.4 بواسون لأنسجة الرئة المستخدمة في هذا العمل هو من قياس العيانية 9. للأسف ، ونسبة بواسون في الحجم الصغير ، وأية تغييرات في ظل حالة المرض ليست متوفرة في الأدب. كما يمكن لبدائل E ، E / (1 - υ 2) أو (1 – υ 2) / πE (تدل على مرونة ك الثابتة) تحسب من 22 microindentation فؤاد وعندما ذكرت أن نسبة بواسون غير معروف. بالنسبة لمعظم المواد الحيوية نسبة بواسون في نطاق 0،4-0،5 بسبب محتواها المياه العالية. في نطاق 0،3-0،5 ، عامل 1 / (1 - υ 2) يختلف فقط 1،10-1،33 ، ان هذه الاختلافات في نسبة معقولة من بواسون الى تأثيرات طفيفة على المعامل عنها. الزيادة في معامل القص أننا تقرير عن النسبية نسيج متليف إلى الأنسجة الطبيعية هي أضعاف عدة في الحجم ، مما يعني أن الأخطاء المرتبطة مع وجود اختلافات في نسبة بواسون نسبية طفيفة على تغييرات في الخصائص الميكانيكية ملاحظتها.
الخوارزمية الفعلية والبرمجية التي يمكن استخدامها لتحليل البيانات النزوح بالقوة يخضع لشرط تطبيق معين وخصائص لاحقة من مختلف فئات السكان من النزوح بالقوة المنحنيات. إذا كان التحليل هو أكثر تعقيدا من الفوائد ، يمكن للمرء الاطلاع على عمل لين وآخرون 23. الكتاب ترجمة سلسلة من الاستراتيجيات التآزر إلى الخوارزمية التي يتغلب العديد من التعقيدات التي أعاقت جهود سابقا لأتمتة تركيب نماذج البيانات هيرتز المسافة البادئة.
عدة مجالات أخرى متاحة لمزيد من التنمية واستغلال هذا الأسلوب. في الحالات التي يهتم احد في الرؤية والجدران السنخية الأضداد دون وضع العلامات ، وكلاهما يمكن الإيلاستين والكولاجين يمكن تصور لهم من إشارة autofluorescent في الطيف الخضراء. من ناحية أخرى ، يمكن أن أفضل تصوير ، وذلك باستخدام إما المقاطع أرق النسيج ، وتقنيات التصوير 3D ، أو كليهما ، وتعزيز القدرة على ربط العمارة مع الأنسجة الكامنة الخواص الميكانيكية. في حين أن الأساليب الحالية تسمح للتلوين والتصور من مكونات المصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين وlaminin ، يمكن أن تهدف إلى بذل جهود إضافية في تلطيخ علامات سطح الخلية لتحديد السكان خلية معينة وتحديد سمات microenvironments الميكانيكية في محيط هؤلاء السكان. بديلernatively ، يمكن أن تحصد من أنسجة الفئران معربا عن fluorescently الموسومة النسب علامات أو بروتينات معينة خلية لمتابعة نفس الهدف. أخيرا ، يظهر هنا طريقة مفصلة مناسبة تماما لتوصيف ملامح تشريحية أخرى في الرئة ، مثل السفن التي يعيد في ارتفاع ضغط الدم ، والذي يعيد الهوائية في حالات الربو. بناء على حالته الراهنة من تطور وإمكانات تعزيز مزيد من فؤاد microindentation يبدو تستعد لانتاج رؤى قيمة حول التغييرات في تصلب الأنسجة التي ترافق تطور المرض في الرئة ، ومما لا شك فيه أن تكون ذات قيمة في تشخيص التغيرات المكانية والزمانية في صلابة من مجموعة متنوعة من الانسجة الرخوة الأخرى.
The authors have nothing to disclose.
نشكر ألف باء Tager وشيا لتعاونهم المستمر ، وتوفير أنسجة الرئة تستخدم لأغراض العرض التوضيحي هنا. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL – 092961. تم تنفيذ هذا العمل في الجزء في مركز لأنظمة النانو (CNS) ، وهو عضو في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية ، وهو مدعوم من قبل مؤسسة العلوم الوطنية في إطار جبهة الخلاص الوطني جائزة ECS – 0335765. الجهاز العصبي المركزي هو جزء من كلية الآداب والعلوم في جامعة هارفارد.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |