Se describe aquí un método para la biopsia de mucosa olfatoria de ratas y humanos cavidades nasales. Estas biopsias se pueden utilizar tanto para la identificación de anomalías moleculares en las enfermedades cerebrales o el aislamiento de células madre adultas multipotentes que pueden ser utilizados para el trasplante de células en modelos animales de trauma cerebral / enfermedad
La mucosa olfatoria, que se encuentra en la cavidad nasal, se encarga de detectar olores. También es el único tejido nervioso que se encuentra expuesta al ambiente externo y de fácil acceso en todos los individuos que viven. Como resultado, este tejido es único para cualquier persona con el objetivo de identificar las anomalías moleculares en el cerebro patológico o aislar las células madre adultas para la terapia celular.
Alteraciones moleculares en las enfermedades cerebrales son estudiados a menudo usando muestras de tejido nervioso recogido post-mortem. Sin embargo, este material tiene numerosas limitaciones. Por el contrario, la mucosa olfativa es de fácil acceso y puede hacer una biopsia de forma segura sin ningún tipo de pérdida del sentido del olfato 1. En consecuencia, la mucosa olfativa ofrece una "ventana abierta" en el adulto humano a través del cual se puede estudiar el desarrollo (autismo, la esquizofrenia, por ejemplo,) 2-4 o neurodegenerativas (como Parkinson, Alzheimer) enfermedades 4,5. Mucosa olfatoria se puede utilizar ya sea para estudios comparativos molecular 4,6 o en experimentos in vitro sobre la neurogénesis 3,7.
El epitelio olfativo es también un tejido nervioso que produce nuevas neuronas cada día para reemplazar a aquellos que están dañados por la contaminación, bacterias de infecciones virales. Esta neurogénesis permanente se sustenta por los progenitores, sino también las células madre que residen dentro de los dos compartimientos de la mucosa, es decir, la neuroepithelium y el 10.8 lámina propia subyacente. Recientemente hemos desarrollado un método para purificar las células madre adultas ubicados en la lámina propia y, después de haber demostrado que están estrechamente relacionadas con las células mesenquimales de la médula ósea (BM-MSC), que nombró olfativa ecto-mesenquimal de células madre (OE- MSC) 11.
Curiosamente, en comparación con el BM-MSC, OE-MSC mostrar una tasa de proliferación de alto, un clonogenicidad elevado y una inclinación de diferenciarse en células neuronales. Nos aprovechamos de estas características para llevar a cabo estudios específicos para dar a conocer nuevos genes candidatos en la esquizofrenia y la enfermedad de Parkinson 4. Nosotros y otros han demostrado también que la OE-MSC son candidatos prometedores para la terapia celular, después de un traumatismo de la médula espinal 12,13, un daño coclear en un 14 o modelos animales de enfermedad de Parkinson 15 o amnesia 16.
En este estudio, se presentan los métodos de biopsia de mucosa olfatoria en ratas y humanos. Después de la recolección, la lámina propia es enzimáticamente separada del epitelio y las células madre se purifican mediante un enzimáticos o un método no enzimático. Purificada de células olfativas madre pueden ser cultivadas en grandes cantidades y en bancos en nitrógeno líquido o inducidas a formar esferas o diferenciarse en células neuronales. Estas células madre también se pueden utilizar para ómicas comparativa (genómica, transcriptómica, epigenómico, proteómica) los estudios.
Las técnicas presentadas aquí hacen los roedores y la mucosa olfativa humana un modelo útil para la investigación clínica sobre las causas de las enfermedades del neurodesarrollo y neurodegenerativos, así como una herramienta para reparar el cerebro patológico o traumatizados. El protocolo es relativamente sencillo y puede ser fácilmente llevados a cabo por un biólogo celular de la experiencia. La tasa de éxito de las técnicas de biopsia y cultivo es alto.
Los pasos críticos
Posibles modificaciones
Las futuras aplicaciones
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Asociación Francesa contra las Miopatías), FEDER en PACA y Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encéphale). Nosotros agradecemos a Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Institute) por su ayuda eficiente durante la grabación de lapso de tiempo.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Collection of olfactory mucosa in rats | ||
DMEM/HAM F12 | Invitrogen | 31331-028 |
Sodium Pentobarbital | ||
Rongeur | FST | |
26 gauge needle | Terumo | NN-2613R |
Forceps | ||
Collection of olfactory mucosa in humans | ||
Rigid endoscope | Karl Storz or Richard Wolf Medical | |
Lidocaine | ||
Epinephrine | ||
Throughcut ethmoid forceps | Karl Storz or Richard Wolf Medical | |
Isolation of olfactory stem cells | ||
Dispase II | Roche | 10 295 825 001 |
Dissecting microscope | ||
Micro spatula | FST | |
Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C9891 |
Ca-free/Mg-free PBS | Invitrogen | 14190-250 |
Fetal calf serum | Invitrogen | 10270098 |
Glass coverslip | Knittel Glaser | 001/35 |
Sphere formation and neuronal differentiation | ||
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1274 |
Insulin transferrin selenium (ITS) | Invitrogen | 51500056 |
EGF | R&D Systems | 236-EG |
FGF2 | R&D Systems | 233-FB |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 |
B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 |
Glutamine | Invitrogen | 25030024 |
Glutamate | Sigma-Aldrich |