Nous décrivons ici une méthode pour biopsies muqueuse olfactive de rat et humain des cavités nasales. Ces biopsies peuvent être utilisés soit pour identifier les anomalies moléculaires dans les maladies du cerveau ou d'isoler cellules souches adultes multipotentes qui peuvent être utilisés pour la transplantation de cellules dans des modèles animaux de traumatisme crânien / maladie
La muqueuse olfactive, située dans la cavité nasale, est en charge de détecter les odeurs. Il est également le seul tissu nerveux qui est exposée à l'environnement extérieur et facilement accessible à chaque individu vivant. En conséquence, ce tissu est unique pour quiconque vise à identifier les anomalies moléculaires dans le cerveau pathologique ou isoler les cellules souches adultes pour la thérapie cellulaire.
Les anomalies moléculaires dans les maladies du cerveau sont souvent étudiés en utilisant des échantillons de tissus nerveux prélevés post-mortem. Toutefois, ce matériau a de nombreuses limites. En revanche, la muqueuse olfactive est facilement accessible et peut être biopsiées en toute sécurité sans aucune perte de l'odorat 1. Par conséquent, la muqueuse olfactive offre une «fenêtre ouverte» dans l'homme adulte à travers lequel on peut étudier le développement (par exemple l'autisme, la schizophrénie) 2-4 ou neurodégénératives (par exemple Parkinson, Alzheimer) 4,5 maladies. Muqueuse olfactive peut être utilisé soit pour les études comparatives moléculaires 4,6 ou dans des expériences in vitro sur la neurogenèse 3,7.
L'épithélium olfactif est aussi un tissu nerveux qui produit de nouveaux neurones par jour pour remplacer ceux qui sont endommagés par la pollution, bactéries des infections virales. Cette neurogenèse permanente est soutenue par les progéniteurs, mais aussi des cellules souches résidant dans les deux compartiments de la muqueuse, à savoir le neuroépithélium et les sous-tendent lamina propria 80-10. Nous avons récemment développé une méthode pour purifier les cellules souches adultes situées dans la lamina propria et, après avoir démontré qu'ils sont étroitement liés aux cellules de la moelle osseuse souches mésenchymateuses (CSM-BM), nous avons nommé les cellules souches olfactives ecto-mésenchymateuses (OE- MSC) 11.
Fait intéressant, lorsque comparé à BM-MSC, OE-MSC afficher un taux de prolifération élevé, une clonogénicité élevée et une inclination à se différencier en cellules neurales. Nous avons profité de ces caractéristiques pour réaliser des études dédiées à dévoiler de nouveaux gènes candidats dans la schizophrénie et la maladie de Parkinson 4. Nous et les autres ont aussi montré que OE-MSC sont des candidats prometteurs pour la thérapie cellulaire, après un traumatisme de la moelle épinière 12,13, un dommage cochléaire 14 ou dans un modèle animal de maladie de Parkinson ou d'amnésie 15 16.
Dans cette étude, nous présentons les méthodes pour la biopsie muqueuse olfactive chez les rats et les humains. Après la collecte, la lamina propria est enzymatiquement séparés de l'épithélium et les cellules souches sont purifiés en utilisant une méthode enzymatique ou non enzymatique. Purifié cellules souches olfactives peuvent alors être soit cultivées en grand nombre et mis en banque dans l'azote liquide ou induite pour former des sphères ou différenciées en cellules neurales. Ces cellules souches peuvent aussi être utilisés pour omique comparatif (génomique, transcriptomique, épigénomique, protéomique) des études.
Les techniques présentées ici font le rongeur et humaine muqueuse olfactive un modèle utile pour la recherche clinique sur les causes des maladies neurologiques et neurodégénératives ainsi que d'un outil pour réparer le cerveau pathologique ou traumatisés. Le protocole est relativement simple et peut être facilement réalisée par un biologiste cellulaire expérimentés. Le taux de réussite pour les techniques de biopsie et de la culture est élevé.
Les étapes critiques
D'éventuelles modifications
Les applications futures
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financièrement soutenu par l'ANR (Agence Nationale de la Recherche), l'AFM (Association Française contre les Myopathies ERP), le FEDER en PACA et IRME (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encéphale). Nous tenons à remercier Marie-Pierre Blanchard (Institut Jean Roche) pour son aide efficace lors de l'enregistrement laps de temps.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Collection of olfactory mucosa in rats | ||
DMEM/HAM F12 | Invitrogen | 31331-028 |
Sodium Pentobarbital | ||
Rongeur | FST | |
26 gauge needle | Terumo | NN-2613R |
Forceps | ||
Collection of olfactory mucosa in humans | ||
Rigid endoscope | Karl Storz or Richard Wolf Medical | |
Lidocaine | ||
Epinephrine | ||
Throughcut ethmoid forceps | Karl Storz or Richard Wolf Medical | |
Isolation of olfactory stem cells | ||
Dispase II | Roche | 10 295 825 001 |
Dissecting microscope | ||
Micro spatula | FST | |
Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C9891 |
Ca-free/Mg-free PBS | Invitrogen | 14190-250 |
Fetal calf serum | Invitrogen | 10270098 |
Glass coverslip | Knittel Glaser | 001/35 |
Sphere formation and neuronal differentiation | ||
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1274 |
Insulin transferrin selenium (ITS) | Invitrogen | 51500056 |
EGF | R&D Systems | 236-EG |
FGF2 | R&D Systems | 233-FB |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 |
B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 |
Glutamine | Invitrogen | 25030024 |
Glutamate | Sigma-Aldrich |