Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani

1. Raccolta di mucosa olfattiva in topi Iniziate preparando tre piatti 35 millimetri Petri riempite con DMEM / HAM F12 terreno di coltura in una cappa di cultura pulito. Qualsiasi metodo di eutanasia deve essere approvato preventivamente dalla cura degli animali dell'istituto e sul comitato per l'uso e svolte da personale qualificato. Dopo che il ratto è entrato anestesia profonda con sodio pentobarbital o altre forme di anestesia iniettabili come la chetamina / xylazina, decapitare e togliere la pelle. Anestetici inalatori dovrebbero essere evitati. L'adeguatezza di anestesia sarà valutata pizzico piedi prima di decapitazione. Rimuovere la mascella inferiore con le forbici e con l'aiuto di una pinza ossivora, eliminare i muscoli facciali su entrambi i lati. A partire dalla parte posteriore degli incisivi, rimuovere con una pinza ossivora l'osso che copre la cavità nasale, da un lato alla volta. I turbinati olfattivo entrare in vista come arancio / marrone organi che si trovano nella parte posteriore del naso. Delicatamente scartare il turbinati con una pinza. Utilizzando un ago 26 gauge, isolare la mucosa olfattiva sdraiato sul setto tagliando il tessuto lungo tre direttrici: l'arco della piastra perpendicolare, la lamina cribrosa e il soffitto della cavità nasale. Raccogliere biopsie su entrambi i lati e trasferirli in un DMEM / HAM F12 piena di Petri. Questa procedura non dovrebbe richiedere più di 10 minuti dalla comparsa eutanasia. Ora, al fine di rimuovere il muco, trasferire le biopsie due volte in media riempito piastre di Petri. 2. Raccolta di mucosa olfattiva negli esseri umani Questa procedura deve essere effettuata da un Otorinolaringoiatria (ORL), chirurgo, in conformità con le pertinenti locale comitato etico (s), e ogni ambulatoriale deve firmare un modulo di consenso informato. Usando una 0 ° o 30 ° endoscopio rigido (4 mm di diametro), ispezionare sia cavità nasali e valutare la presenza putativo di polipi o lesioni infiammatorie. Scegli il miglior cavità nasale, tenendo conto della deviazione del setto. Usando un applicatore di cotone, applicare un anestetico locale, come la lidocaina con adrenalina, per 10 minuti. Con una pinza throughcut etmoide, raccogliere a due millimetri quadrati biopsia sia alla radice del mediale del turbinato medio o sul setto nella zona dorsomediale. La biopsia olfattivo viene trasferito, utilizzando un ago sterile, in una sterile 2 ml di tubo riempito con 1 ml di DMEM / HAM F12. Punta il tubo a testa in giù per assicurarsi che la biopsia è immerso nel mezzo di coltura. Inserire il tubo in un contenitore refrigerato e il trasporto al laboratorio di ricerca. In questa fase, la biopsia può essere utilizzato di per sé per gli studi comparativi molecolare focalizzata sulle malattie cerebrali specifici o trattati per la generazione di cellule staminali. 3. Isolamento di cellule staminali da olfattivi dell'uomo e Rat Mucosa Lavare le biopsie in DMEM / HAM F12. Incubare le biopsie in piastre di Petri riempite con 1 ml di soluzione dispasi II (2,4 UI / ml), per 1 ora a 37 ° C. Poi, sotto un microscopio da dissezione con una luce diffratta invertito, l'epitelio olfattivo viene rimosso dal lamina propria sottostante con una spatola micro. L'epitelio olfattivo è più sottile e sembra trasparente su uno sfondo nero rispetto alla lamina propria, che è a strisce arancio / marrone. Su uno sfondo bianco, l'epitelio appare grigia e la lamina propria, marrone. Una volta purificate, trasferire la lamina propria in una capsula di Petri riempite con DMEM / HAM F12. Se il tessuto è di un roditore, quindi tagliare la lamina propria in piccoli pezzi con due aghi di calibro 25. Poi, il trasferimento dei pezzi ad un tubo da 15 ml riempita con 1 ml di collagenasi IA. Nel tubo, usando una pipetta sterile in plastica, dissociare il tessuto. Poi, incubare la provetta per 10 minuti a 37 ° C. Per terminare la dissociazione, agitare delicatamente il tubo e aggiungere 9 ml di Ca-Mg libero e senza PBS e centrifugare a 200 g per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare in DMEM / HAM F12 mezzo di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino, antibiotici e piastra su piatti di plastica cultura. Ora, se il tessuto è umano, allora fetta della lamina propria in 3 a 4 pezzi con uno spessore da 200 a 500 micron. Inserire ogni striscia il meglio di sé 2 piatto cultura cm di diametro e coprire con il tessuto sterile 1,3 scivola in vetro diametro cm copertura. Quindi, aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura (DMEM / HAM F12 supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici) per ogni piatto cultura. Per entrambi i tipi di tessuto, rinnovare il terreno di coltura ogni 2 o 3 giorni. Cinque a sette giorni dopo, le cellule staminali cominciano a invadere il piatto cultura e dopo due settimane dovrebbero essere confluenti. Quando confluenza viene raggiunto, passaggio e trasferimento alle cellule di fiaschi cultura. 4. Sfera Formazione e differe neuronalentiation delle cellule staminali olfattive Per generare sfere di cellule staminali, incubare i palloni per due ore a 37 ° C con poli-L-lisina. (TESTO: 5 g/cm2). Piastra le cellule ad una densità di 16.000 cellule per centimetro quadrato in fiaschi trattati. Ogni due giorni, nutrire le cellule con 0,2 ml per centimetro quadrato di media integrati (DMEM / HAM F12 integrato con l'insulina, transferrina, selenio (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) e FGF2 (50 ng / ml)). Da due a cinque giorni dopo, raccogliere le sfere delle cellule galleggianti e realizzato una nuova targa o dissociare prima innesto in modelli animali di terapia cellulare. Per differenziare le cellule staminali in neuroni olfattivi-come le cellule, li coltivano per 21 giorni in media Neurobasal contenente B-27, penicillina, streptomicina, glutammina e glutammato. Quindi apportare le modifiche di media ogni 3 giorni. Neurone-come le cellule dovrebbero apparire dopo due o tre settimane. 5. Rappresentante dei risultati: Nasale umano espianto-superando le cellule staminali (Figura 2A) si dividono rapidamente e confluenza può essere raggiunto in una o due settimane. Una caratteristica chiave di staminalità, espressione nestina, è stata valutata (Figura 2B). Quando coltivate su poli-L-lisina con un siero privo di mezzo di coltura integrato con EGF (50 ng / ml) e FGF2 (50 ng / ml), le cellule staminali olfattive dar luogo a sfere (figura 2C). Quando coltivate in siero contenente terreno di coltura di nuova sfere placcati dare origine a cellule che esprimono GFAP (~ 50%), tubulina cellule che esprimono (~ 10-15%) e O4 cellule che esprimono (~ 2-5%) 9 (Figure 2D-F). Tuttavia, il destino della sfera cellule derivate possono essere modificati. Per esempio, quando coltivate in un terreno di coltura Neurobasal integrato con B27 e il glutammato, la maggior parte delle cellule staminali olfattive nasale in neurone-come le cellule che esprimono β-tubulina III (Figura 2G) e MAP2 (Fig. 2H). Figura 1. Schema generale dell'esperimento. Biopsie della mucosa olfattiva sono asportati dal ratto o umano cavità nasale. Espianti può essere utilizzato di per sé per gli studi comparativi molecolare al fine di individuare biomarcatori in malattie del cervello. Per isolare le cellule staminali olfattive, le interazioni tra la lamina propria e il neuro-epitelio sono interrotti con la II dispasi enzima e, dopo 45 minuti, l'epitelio viene rimosso con un micro-spatola. Le cellule staminali olfattive roditori vengono ulteriormente selezionati dalla dissociazione della lamina propria con collagenasi IA. Per i tessuti umani, pezzi di lamina propria olfattive sono coltivate sotto vetro coprioggetto fino cellule staminali superando invadere l'intero bene. Dopo la proliferazione, utilizzando un mezzo appropriato coltura, le cellule staminali olfattive possono generare sfere o differenziarsi in neuroni-come le cellule. Le cellule staminali olfattive possono essere usati per i) patologie cerebrali riparazione o trauma o ii) identificare marcatori molecolari di malattie del sistema nervoso centrale. Le illustrazioni sono realizzate con l'ausilio di Arte Servier medica. Figura 2. Cultura e la differenziazione delle cellule staminali nasali olfattive. Cellule staminali umane a crescere senza la lamina propria a espianto (A) dividono rapidamente, quando coltivate in un siero contenente mezzo. Le cellule staminali esprimono la staminalità marcatore nestina (B). Quando placcato in poli-L-lisina rivestite di plastica e coltivati ​​in un siero privo di mezzo di coltura integrato con EGF e FGF2, le cellule staminali olfattive generare sfere (C). Sfera cellule derivate, quando placcato in siero contenente terreno di coltura, danno luogo a cellule che esprimono GFAP (~ 50%), tubulina cellule che esprimono (~ 10-15%) e O4 cellule che esprimono (~ 2-5%) 9 (DF). Quando coltivate in un terreno di coltura Neurobasal integrato con B27 e glutammato, essi si differenziano in neuroni-come le cellule che esprimono β-tubulina III (G) e MAP2 (H).