Dit artikel beschrijft een nieuw protocol en reagensset ontworpen voor de gevoelige meting van de neurotoxische effecten van verbindingen en behandelingen op co-culturen van neuronen en astrocyten met behulp van hoge inhoudsanalyse. Resultaten tonen aan dat de hoge inhoudelijke analyse een spannende nieuwe technologie voor neurotoxiciteit assessment vertegenwoordigt.
Hoge Content Analysis (HCA) assays combineren cellen en detectie reagentia met geautomatiseerde beeldvorming en krachtige beeldanalyse algoritmen, waardoor de meting van meerdere cellulaire fenotypes binnen een enkele assay. In deze studie hebben we gebruik gemaakt HCA om een nieuwe test voor neurotoxiciteit te ontwikkelen. Neurotoxiciteit assessment is een belangrijk onderdeel van de Drug Safety Evaluation, maar ook als een belangrijk aandachtspunt van de bescherming van het milieu inspanningen. Bovendien, neurotoxiciteit is ook een goed geaccepteerde<em> In vitro</em> Marker van de ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer en de ziekte van Parkinson. Onlangs heeft de toepassing van de HCA tot neuronale screening gemeld. Door middel van etikettering neuronale cellen met βIII-tubuline, kan HCA testen leveren high-throughput, niet-subjectieve, kwantitatieve metingen van parameters zoals het aantal neuronale, neurieten tellen en de lengte van neurieten, die allemaal kunnen aangeven neurotoxische effecten. Toch blijft de rol van de astrocyten onontgonnen in deze modellen. Astrocyten hebben een integrale rol in het onderhoud van het centrale zenuwstelsel (CZS) homeostase, en worden geassocieerd met zowel de neuroprotectie en neurodegradation wanneer ze worden geactiveerd als reactie op giftige stoffen of ziekte staten. GFAP is een intermediair filament eiwit voornamelijk tot uiting in de astrocyten van het CZS. Astrocytische activering (gliosis) leidt tot de opregulatie van GFAP, vaak vergezeld door astrocyten proliferatie en hypertrofie. Dit proces van reactieve gliosis is voorgesteld als een vroege marker van beschadiging van het zenuwstelsel. De traditionele methode voor het GFAP kwantificering is door immunoassay. Deze benadering is beperkt door een onvermogen om informatie over de cellulaire lokalisatie, morfologie en mobiele nummer te geven. We hebben vastgesteld dat HCA kunnen worden gebruikt om deze beperkingen te overwinnen en tegelijkertijd te meten met meerdere functies die samenhangen met gliosis – veranderingen in de GFAP expressie, astrocyten hypertrofie en astrocyte proliferatie – binnen een enkele assay. In co-cultuur studies zijn astrocyten is aangetoond dat neuronen te beschermen tegen verschillende types van toxische belediging en kritisch te beïnvloeden neuronale overleving. Recente studies hebben gesuggereerd dat het gebruik van astrocyten in een<em> In vitro</em> Neurotoxiciteit testsysteem kunnen blijken meer relevant zijn voor het menselijk CNS structuur en functie dan de neuronale cellen alleen. Daarom hebben we een HCA test voor co-cultuur van neuronen en astrocyten, bestaande uit protocollen en gevalideerd target-specifieke detectie reagentia voor het profileren van βIII-tubuline en gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP). Deze test maakt gelijktijdige analyse van neurotoxiciteit, neurietuitgroei, gliosis, neuronale en astrocytaire morfologie en neuronale en astrocytaire ontwikkeling in een breed scala van cellulaire modellen, wat neerkomt op een nieuwe, niet-subjectieve, high-throughput assay voor neurotoxiciteit beoordeling. De test biedt veel mogelijkheden voor een verbeterde detectie van neurotoxiciteit en verbeterde productiviteit in de neurowetenschappen onderzoek en drug discovery.
Tot op heden hebben in vitro experimenten ontworpen om neurotoxiciteit risico-evaluatie met behulp van gemengde culturen van neuronen en astrocyten studie is beperkt. Het is goed aanvaard dat gliale cellen zijn integraal in het verstrekken van ruimtelijke en metabole ondersteuning aan neuronen, en spelen een cruciale rol bij het moduleren van verschillende neuronale functies, waaronder neuronale migratie, differentiatie en synaptische activiteit. Gliale astrocyten ook los cytokinen en andere oplosbare factoren die in staat zijn zowel induceren negatieve reacties in de omliggende neuronaal weefsel, alsmede de bevordering van neuronale tolerantie van de vele giftige stoffen. Demonstratie van de diepte van de neuronale-gliale interacties, in co-cultuur studies zijn astrocyten is aangetoond dat neuronen te beschermen tegen de toxiciteit van oxidatieve stress, terwijl de aantasting van astrocytaire functies, zoals het onderhoud van de anti-oxidant verdediging en cellulaire energie niveaus, is aangetoond dat kritisch invloed van neuronale overleving. Recente studies hebben gesuggereerd dat het gebruik van astrocyten in een in vitro neurotoxische test-systeem alleen kunnen blijken meer relevant zijn voor de mens centraal zenuwstelsel structuur en functie dan de neuronale cellen. Ondanks het groeiende bewustzijn van de fysiologische betekenis van de neuronale-astrocytaire interacties, is het eerder moeilijk om kwantitatieve analyses van deze interacties uit te voeren in intacte cellen. De komst van High Content Screening maakt de ontwikkeling van krachtige nieuwe assays aan te pakken dit.
In deze studie hebben we aangetoond dat kwantitatieve analyses van meerdere neuronale en astrocytaire fenotypen in een enkele assay worden mogelijk gemaakt door HCA. Bij primaire neuronen we hebben uitgevoerd kwantitatieve metingen van neurotoxiciteit merkers zoals neuronale nummer, neurieten tellen en neurieten lengte. In astrocyten, reactief gliosis is een bekende biomarker van neurotoxiciteit, gekenmerkt door veranderingen in GFAP expressie, astrocyten nummer en astrocyte morfologie. We hebben aangetoond dat elk van deze eindpunten gemakkelijk kunnen worden beoordeeld via HCA. Deze studies ondersteunen het concept dat HCA van neurale-specifieke biomarkers kunnen worden gebruikt als onderdeel van een reeks van in vitro-tests om snel het scherm een groot aantal chemicaliën voor neurotoxische eindpunten.
Millipore HCS222 Hoge Content Analysis kit voor co-cultuur van neuronen en astrocyten bestaat uit kwalitatief hoogwaardige detectie-reagentia en-protocollen voor het gelijktijdig profileren βIII-tubuline en gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) in een breed scala van cellulaire modellen van neurotoxiciteit. De zeer-gevalideerde reagentia, die bij deze kit kan de gebruiker testen te standaardiseren, test-to-assay variabiliteit te minimaliseren, en reproduceerbaar te genereren beelden met een hoge signaal-achtergrond verhouding.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Drs bedanken. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matthew Hsu, Jehangir Mistry en Michele Hatler voor ondersteuning tijdens de ontwikkeling van deze projecten en protocollen.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
||
Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
||
Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
||
K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
||
DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
||
Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
||
tissue culture-treated black/clear bottom microplates | ||||
HCS imaging/analysis system |