A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

Preparação de células: Antes da semeadura de células para o ensaio, a cultura de neurônios / astrócitos em meios de crescimento até confluentes ~ 70-80% (a menos de células semeadura diretamente do degelo ou isolamento). Separar as células dos frascos de cultura / placas através do método apropriado para o tipo de células de interesse. Se necessário, os poços casaco ensaio de placa com poli-D-lisina ou proteína de matriz extracelular para melhorar a adesão celular. Co-culturas de astrócitos e neurônios pode ser semeado simultaneamente ou seqüencialmente. Para seedings seqüencial, chapeamento de astrócitos primeiro como uma camada de "basal" é recomendado, seguido por plaqueamento neuronal e diferenciação, se necessário. Ajustar a densidade de células, conforme apropriado para o tipo de célula, o tempo da cultura subseqüente, os parâmetros de interesse, etc Dependendo da idade da cultura, fonte de células e densidade de semeadura, culturas primárias podem variar muito em taxa de proliferação, GFAP expressão ou crescimento de neuritos – é importante caracterizar e otimizar seu sistema de célula para fornecer a relevância biológica mais para o seu modelo experimental, bem como para fornecer para geração de imagens eficaz, segmentação e análise usando HCS (ver Figura 1). Depois de adicionar células a placa (células podem ser semeadas em 90 mL de mídia, para facilitar o tratamento com toxina, como descrito no Passo 3 abaixo), permitir que a placa se sentar sobre uma superfície plana em temperatura ambiente por 15-30 min, permitindo distribuição uniforme de células. Após este período, as células se desenvolvem em meios de crescimento (37 ° C / 5% CO 2) por pelo menos 24 horas, em seguida, mudar as condições de cultura de diferenciação (por exemplo, soro baixo / NGF de PC12 células), conforme o caso. Continue cultura até atingir o nível desejado células de confluência ou diferenciação, mudando media em intervalos apropriados para o tipo de célula. Tratamentos com células (compostos de controle, compostos de teste, etc) pode ser introduzido em qualquer momento durante este período da cultura, conforme apropriado para o tempo-curso de tratamento de interesse. Acrilamida, peróxido de hidrogênio e K-252 são fornecidas como compostos neurotóxicos controle. Reagentes suficientes são fornecidos para duplicar de 12 pontos curvas dose-resposta (incluindo uma dH 2 O DMSO ou de controle situado no dose-resposta) para todas as cinco placas de 96 poços. Os compostos são fornecidos em concentração 250X (para K-252a, assumindo um tratamento máximo de 1 mM) ou 10X (para acrilamida e peróxido de hidrogênio, supondo que tratamentos máximo de 100 mm e 10 mm, respectivamente). Preparação tratamento recomendado envolve meia-log (1: √ 10) diluição em série do composto 250X em DMSO, seguido de diluição em tampão de diluição Composto de 10X (compostos controle 10X originários de dH 2 O pode ser serialmente diluída diretamente em dH 2 O estéril ou tampão de diluição Compound). 10 L de cada tratamento podem então ser adicionados ao mL 90 de meios de cultura já está presente em cada poço, para uma concentração final de 1X (0,4% DMSO ou 10% dH 2 O). De dados de exemplo é fornecido por 24 ou 96 horas de tratamento composto de 37 ° C antes da fixação. Fixação de células e coloração de imunofluorescência: Nota: O tempo de coloração é de aproximadamente 2,5 horas pós-fixação. Não permitir que os poços a secar entre as etapas de coloração. Aspiração e dispensação de reagentes devem ser realizadas a taxas de fluxo baixo para diminuir a perda de células devido ao cisalhamento de fluidos. Todos os recomendados "por bem" volumes referem-se a um único poço de uma microplaca de 96 poços. Todos os recomendados 'por 96 poços da placa' volumes incluem excesso de 25% as perdas de líquido manipulação de volume. Todas as etapas são realizadas coloração à temperatura ambiente (RT). Todos os tampões e soluções de anticorpos são estáveis ​​por pelo menos 24 horas à temperatura ambiente. No final do período de cultivo, pré-aquecido solução de fixação HCS (2X) a temperatura ambiente (RT) ou 37 º C, se desejar (12 placa mL/96-well). Em uma Cobertura de vapores químicos, adicionar 100 mL / poço diretamente para meios de cultura e permitir que a correção para 30 min em temperatura ambiente. Remover fixador / toxina contendo mídia e eliminar de acordo com os regulamentos para resíduos perigosos (ver MSDS). Se proceder imediatamente à coloração, lavar cada poço duas vezes com 200 mL de tampão de imunofluorescência HCS. Alternativamente, se as placas devem ser manchado em um momento posterior, lavar duas vezes com 200 mL de tampão de lavagem, enxágüe em seguida, deixar o volume segundo em poços e as placas loja hermeticamente fechado a 4 º C até coloração. Se as amostras fixas foram armazenadas a 4 º C antes da coloração, lavar duas vezes com 200 mL de buffer HCS Imunofluorescência antes de prosseguir com protocolo de coloração. Prepare solução de trabalho de Coelho Anti-βIII tubulina / Mouse Anticorpos Anti-GFAP HCS primária (6 placa mL/96-well) como segue: Adicionar 60 mL de cada anticorpo primário para 5,88 descongelado mL de tampão de imunofluorescência HCS. Misture bem. Remover o tampão de imunofluorescência anterior enxaguar. Adicionar 50 mL de solução de anticorpo primário a cada poço e incubar por 1 hora em temperatura ambiente. Remover o anticorpo primáriosolução. Enxaguar três vezes com 200 mL de buffer de imunofluorescência HCS. Preparar a solução de trabalho de HCS Anticorpo secundário / HCS Hoechst Nuclear Stain (6 placa mL/96-well) como segue: Adicionar 30 mL de cada anticorpo secundário descongelados e 30 mL de descongelado Hoechst HCS Nuclear Stain para 5,91 mL de tampão de imunofluorescência HCS. Misture bem, protegendo solução da luz. Remover anterior HCS buffer de imunofluorescência enxaguar. Adicionar 50 mL de HCS Anticorpo secundário / HCS Hoechst solução Nuclear Stain e incubar por 1 hora a RT, protegido da luz. Remover HCS Secundária Antibody / Hoechst HCS solução Nuclear Stain. Enxágüe duas vezes com 200 mL de buffer de imunofluorescência HCS. Remover anterior HCS buffer de imunofluorescência enxaguar. Enxágüe duas vezes com 200 mL de tampão de lavagem HCS, deixando o volume enxágüe segundo poços. Placa de vedação e de imagem de imediato, armazenar ou placa a 4 º C protegido da luz até que esteja pronto para geração de imagens. Aquisição e Análise de Imagem: De imagem e análise de lâminas coradas pode ser realizada de uma variedade de plataformas disponíveis HCS, incluindo a IN Analyzer Cell (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Científica) ou o Opera (Perkin Elmer). Algumas diretrizes para a imagem e análise são apresentadas na Tabela 1: HCS222 Aquisição Diretrizes Imagem Reagente de detecção Lente objetiva Faixa de excitação Filtro [pico / largura de banda (nm)] Emissão Faixa de filtro [pico / largura de banda (nm)] Hoechst HCS Nuclear Stain 20X 360/40 460/40 (ou 535/50, se necessário) HCS Anticorpo secundário, FITC-Donkey anti-IgG de coelho 20X 480/40 535/50 HCS Anticorpo secundário, Cy3-Donkey anti-rato IgG 20X 535/50 600/50 HCS222 Análise Diretrizes Imagem Parâmetro celular Detecção Segmentação / Medição Fundamentação Número de células, características nucleares Hoechst HCS Nuclear Stain Região nuclear (460 canais de emissão nm). Contar o número de núcleos. Conteúdo de DNA (intensidade nuclear) ou análises área nuclear também são possíveis. Use o número de células, características nucleares para determinar a perda de células, fenótipos toxicidade, etc Can "filtro" para aqueles núcleos associados βIII-tubulina ou expressão GFAP para obter em separado contagem de células neuronais e astrocitária / caracterizações (fortemente recomendado). βIII-tubulina Expressão, crescimento de neuritos HCS Anticorpo secundário, FITC-conjugado Região citoplasmática (535 nm de emissão do canal). FITC sinal pode ser usado para distinguir os corpos celulares neuronais de neurites (por exemplo, através de áreas de célula mínima / média do corpo, comprimentos neurite mínimo / máximo e largura). Determinar parâmetros como o comprimento neurite total, contagem de neurite / celular, etc Medições de crescimento de neuritos pode ser modulada durante a diferenciação neuronal ou como resultado de uma lesão química, estados de doença, etc, podem "filtrar" os corpos celulares para aqueles associados com βIII-tubulina expressão para obter a caracterização neuronal distintos (fortemente recomendado). GFAP Expressão, Área astrocitária HCS Anticorpo secundário, Cy3-conjugados Região citoplasmática (600 canais de emissão nm). Cy3 sinal pode ser usado para definir a segmentação do citoplasma de astrócitos. Determinar parâmetros como a intensidade de sinal média citoplasmática, área da célula, etc GFAP expressão e área de células astrócitos pode ser modulada durante o desenvolvimento de astrócitos ou como resultado de uma lesão química, estados de doença, etc, podem "filtrar" os corpos celulares para aqueles associados com a expressão GFAP astrocitária para obter a caracterização distintos (fortemente recomendado). . Tabela 1 Imagem Diretrizes de Aquisição e Análise – HCS222 βIII-Tubulin/GFAP Assay (Co-Cultura) Resultados representativos: Figura 1. βIII-tubulina e GFAP immunofluorescence de rato misturado culturas de células neurais. Co-culturas de astrócitos do hipocampo de ratos primária com neurônios de rato, quer primária ou hipocampo de ratos células PC12 foram gerados por placas pré-astrócitos durante vários dias em cultura, seguido de semeadura neuronal. Neurônios primários foram cultivadas por mais 11 dias, enquanto PC12s foram cultivadas por mais dois dias sob condições de diferenciação (soro baixo / NGF). Manipulação de células fixação e imunomarcação foram realizadas de acordo com protocolos HCS222 ensaio. As células foram fotografadas no GE IN celular Analyzer 1000 (3.3) a 20X (neurônios primários) ou de ampliação objetiva de 10X (PC12) e analisados ​​com o GE IN celular Workstation 1000 Analyzer (3.4) crescimento de neuritos e algoritmos de análise multi-alvo Painel superior.: imagens fundidas de Hoechst HCS Nuclear Stain (azul), βIII-tubulina (verde) e GFAP fluorescência (vermelho). Análise em separado do canal de fluorescência βIII-tubulina permite a segmentação crescimento de neuritos (painel do meio: corpos celulares descritos no azul (neurônios primários) ou amarelo (PC12), neurites em verde (neurônios primários) ou azul claro (PC12)). Análise do canal de GFAP permite a segmentação de astrócitos (painel inferior: núcleos delineados em azul, o citoplasma em verde). GFAP segmentação para o primário do hipocampo de ratos neurônio / astrócitos co-cultura demonstra a capacidade de distinguir entre os núcleos / célula corpos que são GFAP (+) (verde contornos) e aqueles que são GFAP (-) (vermelho), permitindo a contagem de células separadas para neurônios e astrócitos em uma configuração de cultura mista. Figura 2. Respostas dose de rato principal do hipocampo neurônio / astrócitos co-culturas a estresses tóxicos. Astrócitos do hipocampo de ratos primária (P6) foram semeadas em placas de 96 poços em meio de crescimento e cultivadas por 6 dias. Neurônios de rato principal do hipocampo (direto de descongelar) foram semeadas em cima do pré-plated astrócitos e cultivadas em meio de crescimento por 11 dias. As células foram tratadas com diluições seriadas de acrilamida ou peróxido de hidrogénio (máx. = concentração 100mM e 10mM, respectivamente) para as últimas 24 horas de cultura. Manipulação de células fixação e imunomarcação foram realizadas de acordo com protocolos HCS222 ensaio. As células foram fotografadas no GE IN celular Analyzer 1000 (3.3) a 20X (10 campos / poço) e analisadas (nuclear / cytoplasmic / neurite segmentação) usando o GE IN celular Workstation 1000 Analyzer (3.4) crescimento de neuritos e algoritmos de análise multi-alvo. Os dados apresentados são média ± EPM, n = 3. Vários parâmetros (crescimento de neuritos, intensidade GFAP, área de astrócitos e contagem de células neuronais ou astrocitária) foram investigados por dose-dependente tendências.