Summary

机械稳定的自组装肽水凝胶的制备

Published: September 06, 2024
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Summary

该方案提出了三种快速简单的制备方法,它们利用环境条件触发肽自组装成水凝胶。此外,描述了肽水凝胶的表征,表明可以在这些简单的条件下形成机械稳定的肽水凝胶。

Abstract

肽水凝胶是由纳米纤维或聚合物自组装形成的高度亲水性三维网络凝胶,可形成锁水网络。它们的形态与细胞外基质的形态非常相似,使它们能够同时表现出肽的生物学功能和反应性凝胶特性。这些独特的特性使其在组织工程、三维细胞培养、癌症治疗、再生医学和其他生物医学领域得到广泛应用。本文介绍了使用具有环境响应性凝胶化过程的自组装肽制备 ECF-5 肽水凝胶的三种方法:(1) pH 响应性凝胶化:不同的 pH 值诱导氨基酸残基的质子化或去质子化,改变肽分子之间的静电相互作用并促进它们自组装成水凝胶;(2)金属离子加成:多价金属离子与带负电荷的氨基酸残基螯合,作为肽之间的桥梁,形成网络水凝胶;(3) 溶剂交换:疏水性肽最初溶解在非极性有机溶剂中,随后在过渡到极性水性环境中时诱导自组装成水凝胶。这些方法利用传统的实验程序来促进肽自组装成水凝胶。通过设计肽序列以符合特定的凝胶诱导条件,可以实现精细调整的微/纳米结构和生物学功能,突出了肽水凝胶在生物医学领域的巨大潜力。

Introduction

通过肽序列的设计,肽之间的非共价相互作用诱导自组装,从而形成有序的微米和纳米结构,包括纳米管、纳米带、纳米纤维和球形结构1。当自组装成微米和纳米纤维/带时,这些结构在宏观上表现出水凝胶特性。肽自组装水凝胶与聚合物水凝胶的不同之处在于,它们通过非共价相互作用进行自组装,它们的凝胶形式是可逆的,并且它们很容易对特定条件做出反应,以在溶液相和凝胶相之间转换2。例如,芳香族氨基酸肽可以通过溶剂切换诱导凝胶化 3,4,5,RADA16 肽通过阳离子和阴离子静电相互作用形成凝胶 6,E1Y9 肽通过 Ca2+ 离子诱导形成水凝胶 7。天然氨基酸可被人体代谢并提供出色的生物相容性,这是聚合物水凝胶无法达到的特性8.蛋白质是执行生物功能的分子,肽序列的差异创造了它们特定的生物学功能。因此,嵌入特定的生物功能肽序列并赋予它们自组装特性可以设计具有独特生物学功能和形态的肽自组装水凝胶 9,10,11。本文介绍了三种制备肽水凝胶的方法,其中凝胶化过程由环境响应性触发。它还简要讨论了表征肽水凝胶的机械性能和形态的方法。

pH 值调节氨基酸的电荷,触发一些肽的凝胶化。例如,带正电荷的氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)受 pH 值调节以达到正或中性状态。带负电荷的氨基酸受 pH 值调节以达到负态或中性状态,远离其等电点,从而改变它们在水溶液中的亲水性。因此,控制肽之间的静电和疏水相互作用有助于它们有序的自组装。Zhang 等人设计了一种两亲性 pH 响应性自组装肽,甲氨蝶呤偶联的 KKFKFEFEF,它在体外和体内都对微酸性环境做出反应,实现溶胶到凝胶的相变。这导致有效的细胞摄取和内吞作用,从而递送抗癌药物并提高化疗效果12。Shen 等人13 设计了 FF8 (KRRFFRRK) 肽,它在 pH 值大于 9.4 时很容易自组装成纤维。在中性条件下,微生物由于与带负电荷的磷脂膜发生静电相互作用而中和其正电荷,与磷脂分子协调自组装,导致膜破裂并增强杀菌效果13

使用配位金属触发肽超分子自组装到水凝胶中是一种相对罕见的方法14。当金属离子与肽静电相互作用时,它们会形成连接肽分子的盐桥,导致非共价相互作用和自组装,从而产生凝胶化特性。例如,Abul-Haija 等人15 设计了三肽 FFD,它在添加铜离子后从液体转变为水凝胶。Tao 等人16 开发了富含谷氨酸和苯丙氨酸的肽 E3F3,它在锌离子存在下自组装成纤维水凝胶,用于前列腺药物递送。

肽水凝胶的溶剂交换形成是最常见的超分子自组装触发条件。疏水性肽溶于有机溶剂后,其疏水性基团完全暴露。当转移到水相时,疏水基团相互接近,水分子促进肽氢键的形成,导致快速自组装和容易形成水凝胶。例如,Zhang 等人17 设计了一种肽,它可以在高浓度下稳定溶解在极性有机溶剂中,并在用水稀释后自组装成β片结构以形成肽纤维水凝胶。Shen 等人13 设计了一种还原肽 ECF-5 (ECAFF),预溶于二甲基亚砜 (DMSO) 中,然后注入水相中形成还原水凝胶,用于靶向去除缺血再灌注产生的活性氧,这些活性氧随后在清除后降解成溶液。

本研究根据以往的经验选择了三种简单、快速且高度通用的肽水凝胶制备策略:(1) pH 响应法:将肽溶解在 pH 值远离其等电点的溶液中,然后将 pH 值调节到等电点附近。这种变化允许某些自组装肽形成纤维并产生肽水凝胶;(2) 金属离子加成法:将配位阳离子添加到水溶性、带负电荷的自组装肽中。肽之间的金属配位螯合导致它们自组装成水凝胶;(3)溶剂交换法:将高浓度肽溶于有机溶剂中,然后稀释成水相,诱导凝胶化行为。

Protocol

本研究中使用的质粒、试剂和设备的详细信息列在 材料表中。 1. pH 响应法 将 5 mg ECF-5 肽添加到 400 μL 去离子水中。在 40 kHz 下超声处理 30 分钟并充分混合。 向肽溶液中加入 40 μL 氢氧化钠(1 M,通过 0.22 μm 过滤器过滤)。涡旋并充分混合。继续超声处理 15 分钟,直到溶液完全澄清。 加入 60 μL 盐酸。快速涡旋并确保充分混合。让混合物在室温下静置 30 分钟以上,以促进水凝胶的形成。注:如果需要,用所需的缓冲溶液替换去离子水。如果固体颗粒很大,请提前将其粉碎。超声处理以在液体中获得均匀的颗粒混合物。如果肽不耐碱性条件,请先加入 1 M 盐酸溶液,然后重复上述步骤。根据需要调整酸和碱的量,使其接近等电点或所需的 pH 值,确保保持凝胶形成特性。 2. 金属离子加成法 材料的准备在 pH 7.4 下制备 0.15 M Tris 和 0.1 M NaCl 缓冲液。通过 0.22 μm 过滤器过滤并在 4 °C 下储存长达一周。 使用步骤 1.1.1 中制备的缓冲液制备浓度为 10 mg/mL 的 ECF-5 自组装肽溶液。通过超声溶解并储存在 4 °C。 使用去离子水制备 50 mg/mL 氯化钙溶液。储存在 4 °C。 金属离子添加诱导肽水凝胶形成将 40 μL 氯化钙溶液添加到 460 μL ECF-5 肽溶液中。涡旋并充分混合。让混合物在室温下静置 2 小时以上。注:避免使用磷酸盐缓冲液,因为它可能导致钙离子沉淀。 3.溶剂交换法 材料准备称取 10 mg ECF-5 肽冻干粉。将其添加到 100 μL 的 DMSO 中。使用超声彻底混合并储存在 4 °C。 制备 10 mM 的 PBS 缓冲溶液。过滤和消毒。储存在 4 °C 并在 1 周内使用。 溶剂诱导的肽水凝胶形成将 1 mL PBS 快速引入 DMSO 溶解的肽中。涡旋并充分混合。让它在室温下静置 5 分钟。 加入 500 μL PBS,静置 15 分钟,弃去上清液,保留底部凝胶。重复此过程 3 次以去除 DMSO。注:如果 DMSO 影响后续实验,请考虑将肽溶解在更高浓度的 DMSO 中,以尽量减少其影响。 4. 水凝胶的流变力学表征 流变分析将水凝胶舀到 25 mm 铝制平行板上。使用流变仪18 对肽水凝胶进行动态时间扫描流变分析。 频率和应变扫描分析使用 0.3% 的受控应变和 10 rad/s 的频率系统地进行频率和应变扫描分析18 。确保温度控制设置为 25 °C。 5. 纤维形态的原子力显微镜 (AFM) 表征 材料准备制备 95% 乙醇溶液并添加 5% APTES。储存在 -20 °C 并在 1 个月内使用。 涂上双面胶以去除一层云母。使用 APTES 溶液粘附云母表面,静置 5 分钟。使用前用纯净水彻底冲洗。 稀释并充分混合水凝胶。将其滴到改性的云母表面上,静吸附 5 分钟。用纯净水冲洗表面并在使用前擦干。 检测方法利用配备扫描仪的多模式 AFM 来检查肽纤维或水凝胶形态。使用标称弹簧常数为 48 N/m 的硅悬臂。 初始化仪器以定位针。选择 点击 模式以扫描样品以获取图像。

Representative Results

本文中描述的三种制备肽水凝胶的方法可实现快速、经济和直接的生产。水凝胶的功能与其肽序列有关。在这里,ECF-5 肽被用作代表性示例来证明其物理特性,包括微观形态和机械性能。 如图 1A 和 补充图 1 所示,ECF-5 肽包含一个谷胱甘肽样序列和一个苯丙酰二肽序列,这赋予了它谷胱甘肽的还原特性和自组装的能…

Discussion

在过去的几十年里,随着淀粉样蛋白衍生的自组装肽序列的发现,已经根据其特性设计了许多自组装肽,在生物医学和材料科学中显示出巨大的应用潜力19。肽水凝胶在组织培养、药物递送和肿瘤治疗中表现出独特的生物功能化能力20

本文介绍了三种肽水凝胶的简单快速制备方法:pH 响应、金属离子添加和溶剂交…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究得到了国家自然科学基金(11674344 和 22201026 号)和中国科学院前沿科学重点研究计划(批准号 QYZDJ-SSW-SLH019)的支持。

Materials

3-Aminopropyl)triethoxysilane Aladdin A107147 /
Atomic Force Microscopy Bruker Multimode Nanoscope VIII /
CaCl2 Aladdin C290953 /
Diphenylalanine (FF) Chinesepeptide customizable Purity > 95%
DMSO Sigma-aldrich 34869 /
ECF-5 Peptides Chinesepeptide sequence: ECAFF Purity > 95%
Hydrochloric Acid Aladdin H399657  /
Mica Sigma-aldrich AFM-71856-02 /
Phosphate Buffered Saline Aladdin P492453 /
Rheometer Anton Paar GmbH MCR302 /
Silicon Cantilevers MikroMasch XSC11 /
Sodium Chloride Aladdin C111549 /
Sodium Hydroxide Aladdin S140903 /
TRIS Hydrochloride Aladdin T431531 /

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Zhao, Y., Hu, M., Gong, Y., Zhao, Y., Shen, Z. Preparation of Mechanically Stable Self-Assembled Peptides Hydrogels. J. Vis. Exp. (211), e67267, doi:10.3791/67267 (2024).

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