Summary

Canlı Hücrelerde CRAF'ın 14-3-3 Proteinleri ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi için Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET) Tabanlı Test

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Bu protokol, canlı hücrelerde CRAF kinazın 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için BRET tabanlı bir testi tanımlar. Protokol, hücrelerin hazırlanması, BRET emisyonlarının okunması ve veri analizi için adımların ana hatlarını çizmektedir. Tahlil optimizasyonu için uygun kontrollerin tanımlanması ve sorun gidermenin yer aldığı örnek bir sonuç da sunulmaktadır.

Abstract

CRAF, RAS GTPazların birincil efektörüdür ve KRAS kaynaklı çeşitli kanserlerin tümör oluşumunda kritik bir rol oynar. Ek olarak, CRAF, gelişimsel RASopati, Noonan sendromuna neden olduğu gösterilen germ hattı mutasyonları için bir sıcak noktadır. Tüm RAF kinazlar, 14-3-3 düzenleyici proteinler için çoklu fosforilasyona bağlı bağlanma bölgeleri içerir. 14-3-3’ün bu bölgelere diferansiyel bağlanması, sinyalleşme koşulları altında plazma zarında aktif RAF dimerlerinin oluşumunda ve hareketsiz koşullar altında RAF otoinhibisyonunun sürdürülmesinde önemli roller oynar. Bu etkileşimlerin nasıl düzenlendiğini ve nasıl modüle edilebileceğini anlamak, RAF fonksiyonunu hedefleyen yeni terapötik yaklaşımları belirlemek için kritik öneme sahiptir. Burada, CRAF’ın canlı hücrelerde 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) tabanlı bir testi anlatıyorum. Spesifik olarak, bu tahlil, bir Nano lusiferaz donörüne kaynaşmış CRAF ve bir Halo etiket alıcısına kaynaşmış 14-3-3’ün etkileşimlerini ölçer, burada RAF ve 14-3-3’ün etkileşimi, vericiden alıcıya enerji transferi ve BRET sinyalinin üretilmesi. Protokol ayrıca, bu sinyalin, yüksek afiniteli RAF yerleştirme bölgelerinin her birine 14-3-3 bağlanmasını önlediği gösterilen mutasyonlar tarafından bozulabileceğini göstermektedir. Bu protokol, BRET emisyonlarını okumak, veri analizi yapmak ve protein ekspresyon seviyelerini doğrulamak için ayrıntılı talimatlarla birlikte hücrelerin tohumlanması, transfekte edilmesi ve yeniden kaplanması prosedürlerini açıklar. Ek olarak, optimizasyon ve sorun giderme adımlarıyla birlikte örnek tahlil sonuçları sağlanır.

Introduction

RAF kinazlar (ARAF, BRAF ve CRAF), RAS, GTPazların doğrudan efektörleri ve pro-proliferatif / pro-hayatta kalma yanlısı RAF-MEK-ERK kinaz kaskadının başlatıcı üyeleridir. Son çalışmalar, CRAF ekspresyonunun küçük hücreli dışı akciğer kanseri ve pankreas duktal adenokarsinomu 1,2,3,4,5 dahil olmak üzere KRAS kaynaklı çeşitli kanserlerin tümörijenezinde anahtar bir rol oynadığını göstermiştir. Ayrıca, germline CRAF mutasyonları, RASopati’nin özellikle şiddetli bir formu olan Noonan sendromunaneden olur 6,7. CRAF regülasyonunu anlamak, hücrelerdeki işlevini hedefleyen başarılı terapötik yaklaşımlar geliştirmek için kritik öneme sahiptir.

Tüm RAF kinazlar, aktivitesini kontrol eden bir C-terminal katalitik (CAT) alanı ve bir N-terminal düzenleyici (REG) alanı olmak üzere iki fonksiyonel alana ayrılabilir (Şekil 1A)8. REG alanı, RAS bağlama alanını (RBD), sistein açısından zengin alanı (CRD) ve serin/treonin açısından zengin bir bölgeyi (S/T-zengin) kapsar. Özellikle, S/T açısından zengin bölge, fosforilasyona bağlı bir şekilde 14-3-3’e bağlanan N’ bölgesini içerir (CRAF’ta S259; Şekil 1A) 8. CAT alanı, C’ bölgesi olarak adlandırılan ikinci bir yüksek afiniteli 14-3-3 yerleştirme bölgesi ile birlikte kinaz alanını kapsar (CRAF’ta S621; Şekil 1A) 8. Dimerik 14-3-3 proteinlerinin CRD ile birlikte N’ ve C’ bölgelerine diferansiyel bağlanması, hem RAF aktivasyonunda hem de inhibisyonda kritik rol oynar 9,10,11,12,13. Normal sinyalleşme koşulları altında, RAF aktivasyonu, RAS tarafından plazma zarına alınmasıyla başlatılır ve BRAF-CRAF heterodimerinin baskın aktif form14,15 olduğu aktif dimerler oluşturmasına izin verir. Dimerik BRAF’ın kriyojenik elektron mikroskobu (Cryo-EM) yapıları ile birlikte BRAF ve CRAF ile yapılan biyokimyasal analizler, bir 14-3-3 dimerinin, her iki RAF protomerinin C’ bölgesine aynı anda bağlanarak aktif RAF dimerlerini stabilize ettiğini göstermektedir (Şekil 1B)9,13,16,17. Tersine, çalışmalar, hareketsiz koşullar altında, RAF’ın, REG alanının CAT alanına bağlandığı veaktivitesini 12,18,19,20 inhibe ettiği sitozolik, otoinhibe edilmiş bir onay benimsediğini göstermiştir. Bu kapalı durum, REG alanındaki CRD ve N’ bölgesine ve CAT alanındaki C’ bölgesine bağlı bir 14-3-3 dimer ile stabilize edilir (Şekil 1B)10,13,21. BRAF’ta bu model, otoinhibe edilmiş BRAF monomerlerinin son Cryo-EM yapıları ve önceki biyokimyasal çalışmalarımız 10,12,13,21,22 tarafından desteklenmektedir. Bununla birlikte, 14-3-3’ün CRAF düzenlemesi23’te inhibe edici bir rol oynadığı gösterilirken, BRAF benzeri bir otoinhibe edilmiş durum, CRAF düzenlemesi12’de daha az rol oynayabilir; bu nedenle, 14-3-3 proteinlerinin CRAF aktivitesini düzenlediği mekanizmaları açıklığa kavuşturmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. RAF kinazların 14-3-3 aracılı regülasyonu, çok sayıda RAF fosforilasyonu ve fosforilasyon de-fosforilasyon olayı, çeşitli düzenleyici proteinlere bağlanma ve plazma zarı8 ile etkileşimler gerektirir. Bu nedenle, 14-3-3-RAF etkileşimlerinin fizyolojik olarak ilgili koşullar altında ve sağlam bir lipid çift tabakasının varlığında ölçülmesi kritik öneme sahiptir.

Bu sorunu ele almak için, NanoBRET (bundan sonra N-BRET olarak anılacaktır; kit detayları için Malzeme Tablosuna bakınız) teknolojisi, CRAF’ın canlı hücrelerdeki 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için yakınlık tabanlı bir test geliştirmek üzere kullanılmıştır (Şekil 1C). Bu BRET tabanlı sistem, Halo618 enerji alıcı ligand22,24 ile etiketlemek için bir proteinin bir nanolusiferaz (Nano) donörü ve diğerinin bir Halo etiketi ile etiketlendiği iki ilgilenilen proteinin (POI) etkileşimlerini ölçer. İlgilenilen proteinlerin etkileşimi, vericiden alıcıya enerji transferi ile sonuçlanır ve bu da BRET sinyalini üretir (Şekil 1C). Son derece parlak Nano donör proteini (emisyon (em) 460 nm) ve Halo618 ligandı (em 618 nm), geleneksel BRET’e göre daha fazla spektral ayırma ve hassasiyet sağlar, bu da onu daha zayıf etkileşimleri incelemek ve bağlanmadaki ince değişiklikleri tespit etmek için ideal bir platform haline getirir24. Gerçekten de, daha önce RAF REG ve CAT alanlarının otoinhibitör etkileşimlerini ölçmek için N-BRET tabanlı bir test geliştirdik, bu da BRAF CRD’deki bir RASopati mutasyonları panelinin karakterizasyonu için gerekliydi ve bu alanın otoinhibisyonu sürdürmek ve yapısal BRAF aktivasyonunu önlemek için kritik önemini gösterdik12.

Burada açıklanan tahlil, bir N-terminal Nano etiketine (Nano-CRAF) kaynaşmış CRAF ve C-terminal Halo etiketine (14-3-3ζ-Halo) kaynaşmış 14-3-3’ün zeta izoformunun etkileşimlerini ölçer; Şekil 1C). Nano-CRAF’ın 14-3-3ζ-Halo ile etkileşimlerinin sağlam bir BRET sinyali ürettiğini ve bunun da 14-3-3’ün N’ bölgesine (S259A) ve/veya C’ bölgesine (S621A) bağlanmasını önleyen mutasyonlar tarafından bozulabileceğini gösteriyoruz. Aşağıdaki protokol, bu testi gerçekleştirmek, optimize etmek ve sorun gidermek için ayrıntılı adımlar sağlar.

Protocol

NOT: Bu test 293FT hücrelerde gerçekleştirilir. İnsan embriyonik böbrek hücrelerinden türetilen, iyi karakterize edilmiş ve kolayca transfekte edilebilir bir epitel hattı. Bu hücrelerin tek bir birleşik 10 cm’lik kültür kabı tipik olarak 20 oyuklu 6 oyuklu doku kültürü plakalarının tohumlanması için yeterli hücre sağlar. Adım 1-3, biyolojik bir güvenlik kabininde steril teknik kullanılarak gerçekleştirilmelidir. 1. Hücre tohumlama (1. Gün) <p cl…

Representative Results

Bu protokolde açıklandığı gibi gerçekleştirildiğinde (Şekil 2), Nano-CRAFWT ve 14-3-3ζ-Halo’nun etkileşimi, 50-60 mBU’luk düzeltilmiş BRET oranları üretmelidir (Şekil 3A; Ek Tablo 1). CRAF, N’ bölgesi ve C’ bölgesi olmak üzere iki fosforilasyona bağlı 14-3-3 yerleştirme bölgesi içerir (Şekil 1)8. Bu nedenle, CRAF: 14-3-3ζ bağlanmasını azaltmak için uyg…

Discussion

Önceki çalışmalar, 14-3-3 proteinlerinin RAF kinazların hem aktivasyonunda hem de inhibisyonunda kritik rol oynadığını göstermiştir. Bu bağlanma olaylarının nasıl düzenlendiğini ve bu etkileşimleri modüle etmenin RAF sinyalizasyonu ve RAF güdümlü onkogenez üzerindeki etkilerini anlamak, CRAF fonksiyonunu hedef alan yeni terapötik güvenlik açıklarını ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, Raf aktivasyon döngüsü, çok sayıda ilişkili protein, translasyon sonrası modifikasyonlar ve hücre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden ZIA BC 010329 proje numarası altında federal fonlarla finanse edilmiştir.

Materials

Antibodies 
HaloTag® mouse monoclonal antibody Promega G9211  Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody R&D Systems MAB10026 Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)  Santa Crus Biotechnology sc-7267 Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody Amersham NA931-1ML  Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9 Roche/Sigma 6365809001
NanoBRET™ kit  Promega N1661  NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate 
DPBS, without Ca++ and Mg++  Quality Biologicals  114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Life Technologies 25300120
DMEM cell culture media Life Technologies 11995073 High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)   Life Technologies 25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)  Life Technologies   15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media  Gibco 31985062 For cell transfection 
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red Gibco 11058021 For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). 
Invitrogen Trypan Blue Stain  Thermo Scientific  T10282 
NP40 lysis buffer  N/A N/A 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer N/A N/A 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. 
Cell lines 
293FT cells (human) Thermo Scientific  R70007 
DNA vectors 
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant  N/A N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo   N/A N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader PerkinElmer 2104 2104-0010  600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter  Thermo Scientific AMQAX1000 
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor  Thermo Scientific   4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)  GraphPad  www.graphpad.com
Other 
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips  Thermo Scientific  94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile  Thomas Scientific 1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ PerkinElmer 6007680 White, polystyrene, tissue culture treated 
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Scientific  C10228

References

  1. Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
  2. Blasco, M. T., et al. Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF. Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).
  3. Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D). Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).
  4. Lito, P., et al. Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors. Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).
  5. Sanclemente, M., et al. c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling. Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).
  6. Razzaque, M. A., et al. Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome. Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).
  7. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).
  8. Terrell, E. M., Morrison, D. K. Ras-mediated activation of the Raf family kinases. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746 (2019).
  9. Kondo, Y., et al. Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases. Science. 366, 109-115 (2019).
  10. Park, E., et al. Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes. Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).
  11. Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394, 88-92 (1998).
  12. Spencer-Smith, R., et al. RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation. Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).
  13. Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding. Nat Commun. 13, 486 (2022).
  14. Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. The importance of Raf dimerization in cell signaling. Small GTPases. 4, 180-185 (2013).
  15. Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling. Mol Cell. 49, 751-758 (2013).
  16. Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O’Neill, E., Kolch, W. Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization. Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).
  17. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Mol Cell. 20, 963-969 (2005).
  18. Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms. J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).
  19. Chong, H., Guan, K. L. Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction. J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).
  20. Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).
  21. Park, E., et al. Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex. Nat Commun. 14, 4580 (2023).
  22. Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay. STAR Protoc. 4, 102461 (2023).
  23. Clark, G. J., et al. 14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain. J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).
  24. Machleidt, T., et al. NanoBRET–A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).
  25. Hekman, M., et al. Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites. J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).
  26. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, 431-435 (2010).
  27. Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity. Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).
  28. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).
  29. Roy, S., et al. 14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo. Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).
  30. Durrant, D. E., et al. Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction. Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).

Play Video

Cite This Article
Spencer-Smith, R. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells. J. Vis. Exp. (205), e66436, doi:10.3791/66436 (2024).

View Video