Summary

Saggio basato sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) per la misurazione delle interazioni di CRAF con proteine 14-3-3 in cellule vive

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Questo protocollo descrive un saggio basato su BRET per misurare le interazioni della chinasi CRAF con le proteine 14-3-3 in cellule vive. Il protocollo delinea i passaggi per la preparazione delle celle, la lettura delle emissioni BRET e l’analisi dei dati. Viene inoltre presentato un risultato di esempio con l’identificazione dei controlli appropriati e la risoluzione dei problemi per l’ottimizzazione del saggio.

Abstract

La CRAF è un effettore primario delle GTPasi RAS e svolge un ruolo critico nella tumorigenesi di diversi tumori guidati da KRAS. Inoltre, la CRAF è un hotspot per le mutazioni germinali, che hanno dimostrato di causare la RASopathy evolutiva, la sindrome di Noonan. Tutte le chinasi RAF contengono più siti di legame dipendenti dalla fosforilazione per le proteine regolatorie 14-3-3. Il legame differenziale di 14-3-3 a questi siti gioca un ruolo essenziale nella formazione di dimeri attivi di RAF sulla membrana plasmatica in condizioni di segnalazione e nel mantenimento dell’autoinibizione di RAF in condizioni di quiescenza. Comprendere come queste interazioni sono regolate e come possono essere modulate è fondamentale per identificare nuovi approcci terapeutici che mirano alla funzione dei RAF. Qui, descrivo un saggio basato sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) per misurare le interazioni di CRAF con le proteine 14-3-3 nelle cellule vive. In particolare, questo test misura le interazioni di CRAF fuso a un donatore di nano luciferasi e 14-3-3 fuso a un accettore di tag Halo, dove l’interazione di RAF e 14-3-3 determina il trasferimento di energia da donatore a accettore e la generazione del segnale BRET. Il protocollo mostra inoltre che questo segnale può essere interrotto da mutazioni che hanno dimostrato di impedire il legame di 14-3-3 a ciascuno dei suoi siti di attracco RAF ad alta affinità. Questo protocollo descrive le procedure per la semina, la trasfetzione e la riplaccatura delle cellule, insieme a istruzioni dettagliate per la lettura delle emissioni di BRET, l’esecuzione dell’analisi dei dati e la conferma dei livelli di espressione proteica. Inoltre, vengono forniti esempi di risultati dei saggi, insieme alle fasi di ottimizzazione e risoluzione dei problemi.

Introduction

Le chinasi RAF (ARAF, BRAF e CRAF) sono gli effettori diretti delle GTPasi RAS e i membri iniziatori della cascata chinasica RAF-MEK-ERK pro-proliferativa/pro-sopravvivenza. Studi recenti hanno dimostrato che l’espressione di CRAF svolge un ruolo chiave nella tumorigenesi di diversi tumori guidati da KRAS, tra cui il carcinoma polmonare non a piccole cellule e l’adenocarcinoma duttale pancreatico 1,2,3,4,5. Inoltre, le mutazioni germinali della CRAF causano una forma particolarmente grave di RASopathy, la sindrome di Noonan 6,7. Comprendere la regolazione del CRAF è fondamentale per lo sviluppo di approcci terapeutici di successo che mirino alla sua funzione nelle cellule.

Tutte le chinasi RAF possono essere suddivise in due domini funzionali, un dominio catalitico C-terminale (CAT) e un dominio regolatorio N-terminale (REG), che ne controlla l’attività (Figura 1A)8. Il dominio REG comprende il dominio di legame RAS (RBD), il dominio ricco di cisteina (CRD) e una regione ricca di serina/treonina (S/T-rich). In particolare, la regione ricca di S/T contiene il sito N’, che si lega a 14-3-3 in modo dipendente dalla fosforilazione (S259 in CRAF; Figura 1A) 8. Il dominio CAT comprende il dominio chinasi, insieme a un secondo sito di docking 14-3-3 ad alta affinità, denominato sito C’ (S621 in CRAF; Figura 1A) 8. Il legame differenziale delle proteine dimeriche 14-3-3 ai siti N’ e C’, insieme alla CRD, svolge un ruolo critico sia nell’attivazione che nell’inibizione di RAF 9,10,11,12,13. In condizioni normali di segnalazione, l’attivazione di RAF è avviata dal suo reclutamento nella membrana plasmatica da parte di RAS, permettendogli di formare dimeri attivi, di cui l’eterodimero BRAF-CRAF è la forma attiva predominante14,15. I saggi biochimici con BRAF e CRAF, insieme alle strutture di microscopia elettronica criogenica (Cryo-EM) di BRAF dimerico, indicano che un dimero 14-3-3 stabilizza i dimeri attivi di RAF legandosi simultaneamente al sito C’ di entrambi i protomeri RAF (Figura 1B)9,13,16,17. Al contrario, gli studi hanno dimostrato che in condizioni di quiescenza, RAF adotta una conferma citosolica, autoinibita, in cui il dominio REG si lega al dominio CAT e ne inibisce l’attività 12,18,19,20. Questo stato chiuso è stabilizzato da un dimero 14-3-3 legato al sito CRD e N’ nel dominio REG e al sito C’ nel dominio CAT (Figura 1B)10,13,21. In BRAF, questo modello è supportato da recenti strutture Cryo-EM di monomeri BRAF autoinibiti e dai nostri precedenti studi biochimici 10,12,13,21,22. Tuttavia, mentre è dimostrato che 14-3-3 svolge un ruolo inibitorio nella regolazione di CRAF23, uno stato autoinibito simile a BRAF può svolgere un ruolo minore nella regolazione di CRAF12; pertanto sono necessari ulteriori studi per chiarire i meccanismi con cui le proteine 14-3-3 regolano l’attività di CRAF. La regolazione mediata da 14-3-3 delle chinasi RAF richiede una pletora di eventi di fosforilazione e de-fosforilazione di RAF, il legame con varie proteine regolatorie e le interazioni con la membrana plasmatica8. Pertanto, è fondamentale che le interazioni 14-3-3-RAF siano misurate in condizioni fisiologicamente rilevanti e in presenza di un doppio strato lipidico intatto.

Per risolvere questo problema, è stata utilizzata la tecnologia NanoBRET (d’ora in poi denominata N-BRET; vedere la Tabella dei materiali per i dettagli del kit) per sviluppare un test basato sulla prossimità per misurare le interazioni di CRAF con le proteine 14-3-3 nelle cellule vive (Figura 1C). Questo sistema basato su BRET misura le interazioni di due proteine di interesse (POI), in cui una proteina è marcata con un donatore di nanoluciferasi (Nano) e l’altra con un tag Halo, per la marcatura con il ligando accettore di energia Halo61822,24. L’interazione delle proteine di interesse si traduce nel trasferimento di energia da donatore a accettore, che a sua volta genera il segnale BRET (Figura 1C). La proteina donatrice Nano estremamente brillante (emissione (em) 460 nm) e il ligando Halo618 (em 618 nm) forniscono una maggiore separazione spettrale e sensibilità rispetto al BRET convenzionale, rendendola una piattaforma ideale per studiare le interazioni più deboli e rilevare sottili cambiamenti nel legame24. Infatti, abbiamo precedentemente sviluppato un test basato su N-BRET per misurare le interazioni autoinibitorie dei domini RAF REG e CAT, che è stato essenziale per la caratterizzazione di un pannello di mutazioni di RASopathy nella CRD di BRAF e ha dimostrato l’importanza critica di questo dominio per mantenere l’autoinibizione e prevenire l’attivazione costitutiva di BRAF12.

Il test qui descritto misura le interazioni tra CRAF, fuso con un tag Nano N-terminale (Nano-CRAF), e l’isoforma zeta di 14-3-3 fusa con il tag Halo C-terminale (14-3-3ζ-Halo; Figura 1C). Dimostriamo che le interazioni di Nano-CRAF con 14-3-3ζ-Halo generano un robusto segnale BRET, che a sua volta può essere interrotto da mutazioni che impediscono il legame di 14-3-3 al sito N’ (S259A) e/o al sito C’ (S621A). Il seguente protocollo fornisce passaggi dettagliati per l’esecuzione, l’ottimizzazione e la risoluzione dei problemi di questo test.

Protocol

NOTA: Questo test viene eseguito in celle 293FT. Una linea epiteliale ben caratterizzata e facilmente trasfettabile derivata da cellule renali embrionali umane. Una singola piastra di coltura confluente di 10 cm di queste cellule fornisce in genere cellule sufficienti per la semina di 20 pozzetti di piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti. Le fasi 1-3 devono essere eseguite utilizzando una tecnica sterile in una cappa di sicurezza biologica. 1. Semina cellulare (giorno 1) …

Representative Results

Se eseguita come descritto in questo protocollo (Figura 2), l’interazione di Nano-CRAFWT e 14-3-3ζ-Halo dovrebbe produrre rapporti BRET corretti di 50-60 mBU (Figura 3A; Tabella supplementare 1). CRAF contiene due siti di attracco 14-3-3 dipendenti dalla fosforilazione, il sito N’ e il sito C’ (Figura 1)8. Pertanto, i controlli appropriati per ridurre il legame CRAF:14-3-3ζ inclu…

Discussion

Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine 14-3-3 svolgono un ruolo critico sia nell’attivazione che nell’inibizione delle chinasi RAF. Comprendere come questi eventi di legame sono regolati e gli effetti della modulazione di queste interazioni sulla segnalazione RAF e sull’oncogenesi guidata da RAF potrebbe scoprire nuove vulnerabilità terapeutiche che mirano alla funzione di CRAF. Tuttavia, il ciclo di attivazione di Raf è supportato da una pletora di proteine associate, modifiche post-traduzionali e cambiamen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto è stato finanziato in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, con il numero di progetto ZIA BC 010329.

Materials

Antibodies 
HaloTag® mouse monoclonal antibody Promega G9211  Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody R&D Systems MAB10026 Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)  Santa Crus Biotechnology sc-7267 Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody Amersham NA931-1ML  Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9 Roche/Sigma 6365809001
NanoBRET™ kit  Promega N1661  NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate 
DPBS, without Ca++ and Mg++  Quality Biologicals  114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Life Technologies 25300120
DMEM cell culture media Life Technologies 11995073 High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)   Life Technologies 25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)  Life Technologies   15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media  Gibco 31985062 For cell transfection 
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red Gibco 11058021 For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). 
Invitrogen Trypan Blue Stain  Thermo Scientific  T10282 
NP40 lysis buffer  N/A N/A 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer N/A N/A 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. 
Cell lines 
293FT cells (human) Thermo Scientific  R70007 
DNA vectors 
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant  N/A N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo   N/A N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader PerkinElmer 2104 2104-0010  600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter  Thermo Scientific AMQAX1000 
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor  Thermo Scientific   4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)  GraphPad  www.graphpad.com
Other 
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips  Thermo Scientific  94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile  Thomas Scientific 1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ PerkinElmer 6007680 White, polystyrene, tissue culture treated 
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Scientific  C10228

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Cite This Article
Spencer-Smith, R. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells. J. Vis. Exp. (205), e66436, doi:10.3791/66436 (2024).

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