المقايسة القائمة على نقل طاقة الرنين للتلألؤ الحيوي (BRET) لقياس تفاعلات CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية
Summary
يصف هذا البروتوكول مقايسة قائمة على BRET لقياس تفاعلات كيناز CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية. يحدد البروتوكول خطوات لإعداد الخلايا ، وقراءة انبعاثات BRET ، وتحليل البيانات. يتم أيضا تقديم مثال على النتيجة مع تحديد عناصر التحكم المناسبة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحسين الفحص.
Abstract
CRAF هو المستجيب الأساسي ل RAS GTPases ويلعب دورا مهما في تكوين الأورام للعديد من السرطانات التي تحركها KRAS. بالإضافة إلى ذلك ، يعد CRAF نقطة ساخنة لطفرات الخط الجرثومي ، والتي ثبت أنها تسبب اعتلال RASopathy التنموي ، متلازمة نونان. تحتوي جميع كينازات RAF على مواقع ربط متعددة تعتمد على الفسفرة ل 14-3-3 بروتينات تنظيمية. يلعب الارتباط التفاضلي ل 14-3-3 لهذه المواقع أدوارا أساسية في تكوين ثنائيات RAF النشطة في غشاء البلازما في ظل ظروف الإشارات وفي الحفاظ على التثبيط الذاتي لسلاح الجو الملكي البريطاني في ظل ظروف هادئة. يعد فهم كيفية تنظيم هذه التفاعلات وكيف يمكن تعديلها أمرا بالغ الأهمية لتحديد الأساليب العلاجية الجديدة التي تستهدف وظيفة سلاح الجو الملكي البريطاني. هنا ، أصف مقايسة نقل طاقة الرنين الحيوي (BRET) لقياس تفاعلات CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية. على وجه التحديد ، يقيس هذا الفحص تفاعلات CRAF المنصهرة مع مانح نانو لوسيفيراز و 14-3-3 المنصهرة مع متقبل علامة Halo ، حيث يؤدي تفاعل RAF و 14-3-3 إلى نقل الطاقة من مانح إلى متقبل وتوليد إشارة BRET. يوضح البروتوكول كذلك أن هذه الإشارة يمكن أن تتعطل بسبب الطفرات التي تظهر لمنع ارتباط 14-3-3 بكل موقع من مواقع الإرساء عالية التقارب لسلاح الجو الملكي البريطاني. يصف هذا البروتوكول إجراءات بذر الخلايا ونقلها وإعادة طلائها ، إلى جانب تعليمات مفصلة لقراءة انبعاثات BRET ، وإجراء تحليل البيانات ، وتأكيد مستويات التعبير عن البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير أمثلة على نتائج الفحص ، جنبا إلى جنب مع خطوات التحسين واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Introduction
كينازات سلاح الجو الملكي البريطاني (ARAF و BRAF و CRAF) هي المستجيبات المباشرة ل RAS GTPases والأعضاء البادئين في سلسلة كيناز RAF-MEK-ERK المؤيدة للتكاثر / المؤيدة للبقاء. أظهرت الدراسات الحديثة أن تعبير CRAF يلعب دورا رئيسيا في تكوين الأورام للعديد من السرطانات التي تحركها KRAS ، بما في ذلك سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة وسرطان الغدة القنوية البنكرياسية1،2،3،4،5. علاوة على ذلك ، تسبب طفرات CRAF الجرثومية شكلا حادا بشكل خاص من اعتلال RASopathy ، متلازمة نونان 6,7. يعد فهم تنظيم CRAF أمرا بالغ الأهمية لتطوير مناهج علاجية ناجحة تستهدف وظيفتها في الخلايا.
يمكن تقسيم جميع كينازات RAF إلى مجالين وظيفيين ، مجال تحفيزي C-terminal (CAT) ومجال تنظيمي N-terminal (REG) ، يتحكم في نشاطه (الشكل 1A)8. يشمل مجال REG مجال ربط RAS (RBD) ، والمجال الغني بالسيستين (CRD) ، ومنطقة غنية بالسيرين / ثريونين (S / T-rich). والجدير بالذكر أن المنطقة الغنية ب S / T تحتوي على موقع N ، الذي يرتبط ب 14-3-3 بطريقة تعتمد على الفسفرة (S259 في CRAF ؛ الشكل 1 أ) 8. يشمل مجال CAT مجال كيناز ، إلى جانب موقع إرساء ثان عالي التقارب 14-3-3 ، يشار إليه باسم موقع C (S621 في CRAF ؛ الشكل 1 أ) 8. يلعب الارتباط التفاضلي للبروتينات 14-3-3 dimeric بمواقع N ‘و C ، جنبا إلى جنب مع CRD ، أدوارا حاسمة في كل من تنشيط وتثبيط RAF9،10،11،12،13. في ظل ظروف الإشارات العادية ، يبدأ تنشيط RAF من خلال تجنيده في غشاء البلازما بواسطة RAS ، مما يسمح له بتكوين دايمرات نشطة ، والتي يكون مغاير BRAF-CRAF هو الشكل النشط السائد14,15. تشير المقايسات الكيميائية الحيوية باستخدام BRAF و CRAF ، جنبا إلى جنب مع هياكل المجهر الإلكتروني المبرد (Cryo-EM) ل dimeric BRAF ، إلى أن dimer 14-3-3 يعمل على استقرار ثنائيات RAF النشطة عن طريق الارتباط في وقت واحد بموقع C ‘لكل من بروتومرات RAF (الشكل 1B) 9،13،16،17. على العكس من ذلك ، أظهرت الدراسات أنه في ظل ظروف هادئة ، يتبنى RAF تأكيدا خلويا ومثبطا ذاتيا ، حيث يرتبط مجال REG بمجال CAT ويمنع نشاطه12،18،19،20. يتم تثبيت هذه الحالة المغلقة بواسطة dimer 14-3-3 المرتبط بموقع CRD و N ‘في مجال REG وموقع C في مجال CAT (الشكل 1B) 10،13،21. في BRAF ، يتم دعم هذا النموذج من خلال هياكل Cryo-EM الحديثة لمونومرات BRAF ذاتية التثبيط ودراساتنا الكيميائية الحيويةالسابقة 10،12،13،21،22. ومع ذلك، ففي حين تبين أن المادة 14-3-3 تؤدي دورا مثبطا في المادة23 من النظام الأساسي لاتفاقية الإبلاغ الموحد، فإن حالة التثبيط الذاتي الشبيهة ب BRAF قد تؤدي دورا أقل في المادة12 من النظام الأساسي للنموذج الموحد؛ لذلك هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتوضيح الآليات التي تنظم بها البروتينات 14-3-3 نشاط CRAF. يتطلب التنظيم بوساطة 14-3-3 لكينازات RAF عددا كبيرا من أحداث فسفرة RAF وإزالة الفسفرة ، والارتباط بالبروتينات التنظيمية المختلفة ، والتفاعلات مع غشاء البلازما8. لذلك ، من الأهمية بمكان أن يتم قياس تفاعلات 14-3-3-RAF في ظل ظروف ذات صلة من الناحية الفسيولوجية وفي وجود طبقة ثنائية دهنية سليمة.
لمعالجة هذه المشكلة ، تم استخدام تقنية NanoBRET (من هنا فصاعدا المشار إليها باسم N-BRET ؛ انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل المجموعة) لتطوير مقايسة قائمة على القرب لقياس تفاعلات CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية (الشكل 1C). يقيس هذا النظام القائم على BRET تفاعلات اثنين من البروتينات ذات الأهمية (POI) ، حيث يتم تمييز أحد البروتينات بمتبرع نانولوسيفيراز (نانو) والآخر بعلامة Halo ، لوضع العلامات باستخدام متقبل الطاقة Halo618 ligand22,24. يؤدي تفاعل البروتينات ذات الأهمية إلى نقل الطاقة من مانح إلى متلقي ، والذي بدوره يولد إشارة BRET (الشكل 1C). يوفر البروتين المانح النانوي شديد السطوع (الانبعاث (em) 460 نانومتر) و Halo618 ligand (em 618 nm) فصلا طيفيا وحساسية أكبر على BRET التقليدي ، مما يجعله منصة مثالية لدراسة التفاعلات الأضعف واكتشاف التغييرات الطفيفة في الربط24. في الواقع ، قمنا سابقا بتطوير اختبار قائم على N-BRET لقياس تفاعلات التثبيط الذاتي لمجالات RAF REG و CAT ، والتي كانت ضرورية لتوصيف لوحة من طفرات RASopathy في BRAF CRD وأظهرنا الأهمية الحاسمة لهذا المجال للحفاظ على التثبيط الذاتي ومنع تنشيط BRAF التأسيسي12.
يقيس الفحص الموصوف هنا تفاعلات CRAF ، المنصهرة في علامة نانو N-terminal (Nano-CRAF) ، وشكل زيتا المتماثل ل 14-3-3 المنصهر في علامة الهالة الطرفية C (14-3-3ζ-Halo; الشكل 1 ج). لقد أظهرنا أن تفاعلات Nano-CRAF مع 14-3-3ζ-Halo تولد إشارة BRET قوية ، والتي بدورها يمكن أن تتعطل بسبب الطفرات التي تمنع ارتباط 14-3-3 بموقع N (S259A) و / أو موقع C (S621A). يوفر البروتوكول التالي خطوات مفصلة لإجراء هذا الفحص وتحسينه واستكشاف الأخطاء وإصلاحه.
Protocol
Representative Results
Discussion
أظهرت الدراسات السابقة أن بروتينات 14-3-3 تلعب أدوارا حاسمة في كل من تنشيط وتثبيط كينازات RAF. إن فهم كيفية تنظيم هذه الأحداث الملزمة وتأثيرات تعديل هذه التفاعلات على إشارات سلاح الجو الملكي البريطاني وتكوين الأورام المدفوع بسلاح الجو الملكي البريطاني قد يكشف عن نقاط ضعف علاجية جديدة تستهدف …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا المشروع جزئيا بأموال فيدرالية من المعهد الوطني للسرطان ، المعاهد الوطنية للصحة ، تحت رقم المشروع ZIA BC 010329.
Materials
| Antibodies | |||
| HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
| NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
| CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
| ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
| Reagents | |||
| X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
| NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
| DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
| Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
| Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
| Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
| NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
| 5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
| Cell lines | |||
| 293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
| DNA vectors | |||
| pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| Equipment | |||
| EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
| Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
| ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
| Other | |||
| ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
| Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
References
- Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
- Blasco, M. T., et al. Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF. Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).
- Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D). Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).
- Lito, P., et al. Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors. Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).
- Sanclemente, M., et al. c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling. Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).
- Razzaque, M. A., et al. Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome. Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).
- Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).
- Terrell, E. M., Morrison, D. K. Ras-mediated activation of the Raf family kinases. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746 (2019).
- Kondo, Y., et al. Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases. Science. 366, 109-115 (2019).
- Park, E., et al. Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes. Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).
- Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394, 88-92 (1998).
- Spencer-Smith, R., et al. RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation. Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).
- Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding. Nat Commun. 13, 486 (2022).
- Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. The importance of Raf dimerization in cell signaling. Small GTPases. 4, 180-185 (2013).
- Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling. Mol Cell. 49, 751-758 (2013).
- Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O’Neill, E., Kolch, W. Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization. Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).
- Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Mol Cell. 20, 963-969 (2005).
- Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms. J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).
- Chong, H., Guan, K. L. Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction. J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).
- Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).
- Park, E., et al. Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex. Nat Commun. 14, 4580 (2023).
- Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay. STAR Protoc. 4, 102461 (2023).
- Clark, G. J., et al. 14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain. J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).
- Machleidt, T., et al. NanoBRET–A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).
- Hekman, M., et al. Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites. J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, 431-435 (2010).
- Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity. Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).
- Roy, S., et al. 14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo. Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).
- Durrant, D. E., et al. Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction. Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).
