Summary

Биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Этот протокол описывает анализ на основе БРЭТ для измерения взаимодействий киназы CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках. В протоколе изложены шаги по подготовке ячеек, считыванию излучений BRET и анализу данных. Также представлен пример результата с идентификацией соответствующих элементов управления и устранением неполадок для оптимизации анализа.

Abstract

CRAF является первичным эффектором ГТФаз RAS и играет решающую роль в онкогенезе нескольких видов рака, вызванных KRAS. Кроме того, CRAF является горячей точкой для мутаций зародышевой линии, которые, как показано, вызывают развитие RASopathy, синдром Нунан. Все RAF-киназы содержат множественные фосфорилирование-зависимые сайты связывания для 14-3-3 регуляторных белков. Дифференциальное связывание 14-3-3 с этими сайтами играет важную роль в образовании активных димеров RAF на плазматической мембране в условиях передачи сигналов и в поддержании аутоингибирования RAF в условиях покоя. Понимание того, как регулируются эти взаимодействия и как они могут быть модулированы, имеет решающее значение для определения новых терапевтических подходов, нацеленных на функцию RAF. В этой статье я опишу анализ на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках. В частности, этот анализ измеряет взаимодействия CRAF, слитых с донором нанолюциферазы, и 14-3-3, слитых с акцептором метки Halo, где взаимодействие RAF и 14-3-3 приводит к передаче энергии от донора к акцептору и генерации сигнала BRET. Протокол также показывает, что этот сигнал может быть нарушен мутациями, которые, как было показано, предотвращают связывание 14-3-3 с каждым из его высокоаффинных стыковочных сайтов RAF. В этом протоколе описаны процедуры посева, трансфекции и повторного посева клеток, а также подробные инструкции по считыванию эмиссии BRET, выполнению анализа данных и подтверждению уровней экспрессии белка. Кроме того, приводятся примеры результатов анализа, а также шаги по оптимизации и устранению неполадок.

Introduction

RAF-киназы (ARAF, BRAF и CRAF) являются прямыми эффекторами ГТФаз RAS и инициирующими членами каскада киназ RAF-MEK-ERK, способствующего пролиферации/выживанию. Недавние исследования показали, что экспрессия CRAF играет ключевую роль в онкогенезе нескольких видов рака, вызванных KRAS, включая немелкоклеточный рак легкого и протоковую аденокарциному поджелудочной железы 1,2,3,4,5. Кроме того, мутации зародышевой линии CRAF вызывают особенно тяжелую форму РАСопатии – синдромНунан 6,7. Понимание регуляции CRAF имеет решающее значение для разработки успешных терапевтических подходов, направленных на его функцию в клетках.

Все RAF-киназы можно разделить на два функциональных домена: С-концевой каталитический (CAT) домен и N-концевой регуляторный домен (REG), который контролирует его активность (рис. 1A). Домен REG включает в себя RAS связывающий домен (RBD), цистеин-богатый домен (CRD) и серин/треонин-богатую область (S/T-rich). Примечательно, что S/T-богатая область содержит N’-сайт, который связывается с 14-3-3 фосфорилированием-зависимым образом (S259 в CRAF; Рисунок 1А) 8. Домен CAT включает в себя домен киназы вместе со вторым высокоаффинным сайтом стыковки 14-3-3, называемым сайтом C’ (S621 в CRAF; Рисунок 1А) 8. Дифференциальное связывание димерных белков 14-3-3 с сайтами N’ и C’, наряду с CRD, играет решающую роль как в активации, так и в ингибировании RAF 9,10,11,12,13. В нормальных сигнальных условиях активация RAF инициируется его привлечением к плазматической мембране RAS, что позволяет ему образовывать активные димеры, из которых гетеродимер BRAF-CRAF является преобладающей активной формой 14,15. Биохимические анализы с использованием BRAF и CRAF, наряду с криогенной электронной микроскопией (Cryo-EM) структур димерных BRAF, показывают, что димер 14-3-3 стабилизирует активные димеры RAF, связываясь одновременно с C’-сайтом обоих протомеров RAF (рис. 1B)9,13,16,17. И наоборот, исследования показали, что в условиях покоя RAF принимает цитозольное, аутоингибированное подтверждение, когда домен REG связывается с доменом CAT и ингибирует его активность 12,18,19,20. Это закрытое состояние стабилизируется димером 14-3-3, связанным с CRD и N’ сайтом в домене REG и с сайтом C’ в домене CAT (рис. 1B)10,13,21. В BRAF эта модель подтверждается недавними крио-ЭМ структурами аутоингибированных мономеров BRAF и нашими предыдущими биохимическими исследованиями 10,12,13,21,22. Однако, в то время как показано, что 14-3-3 играет ингибирующую роль в регуляции23 CRAF, аутоингибированное состояние, подобное BRAF, может играть меньшую роль в регуляции12 CRAF; поэтому необходимы дальнейшие исследования для уточнения механизмов, с помощью которых белки 14-3-3 регулируют активность CRAF. 14-3-3-опосредованная регуляция RAF-киназ требует множества событий фосфорилирования и дефосфорилирования RAF, связывания с различными регуляторными белками и взаимодействия с плазматической мембраной. Поэтому крайне важно, чтобы взаимодействия 14-3-3-RAF измерялись в физиологически значимых условиях и в присутствии интактного липидного бислоя.

Для решения этой проблемы была использована технология NanoBRET (далее именуемая N-BRET; подробную информацию о наборе см. в Таблице материалов) для разработки анализа на основе близости для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках (рис. 1C). Эта система на основе БРЭТ измеряет взаимодействия двух представляющих интерес белков (POI), где один белок помечен донором нанолюциферазы (Nano), а другой — меткой Halo, для мечения лигандом22,24 акцептора энергии Halo618. Взаимодействие представляющих интерес белков приводит к передаче энергии от донора к акцептору, который, в свою очередь, генерирует сигнал BRET (рис. 1C). Чрезвычайно яркий донорский белок Nano (излучение (em) 460 нм) и лиганд Halo618 (em 618 нм) обеспечивают большее спектральное разделение и чувствительность по сравнению с обычным BRET, что делает его идеальной платформой для изучения более слабых взаимодействий и обнаружения тонких изменений в связывании24. Действительно, ранее мы разработали анализ на основе N-BRET для измерения аутоингибиторных взаимодействий доменов RAF REG и CAT, что было важно для характеристики панели мутаций RASopathy в BRAF CRD и продемонстрировало критическую важность этого домена для поддержания аутоингибирования и предотвращения конститутивной активации BRAF12.

Описанный здесь анализ измеряет взаимодействия CRAF, слитого с N-концевой Nano-меткой (Nano-CRAF), и дзета-изоформы 14-3-3, слитой с C-концевой Halo меткой (14-3-3ζ-Halo; Рисунок 1С). Мы показываем, что взаимодействие Nano-CRAF с 14-3-3ζ-Halo генерирует устойчивый сигнал BRET, который, в свою очередь, может быть нарушен мутациями, препятствующими связыванию 14-3-3 с сайтом N’ (S259A) и/или сайтом C’ (S621A). В следующем протоколе подробно описаны инструкции по выполнению, оптимизации и устранению неполадок этого анализа.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ проводится на клетках размером 293 фута. Хорошо охарактеризованная и легко трансфицируемая эпителиальная линия, полученная из эмбриональных клеток почек человека. Одна сливающаяся 10-сантиметровая чашка для культивирования этих клеток обычно обеспечивает доста…

Representative Results

При выполнении в соответствии с описанием в данном протоколе (рис. 2) взаимодействие Nano-CRAFWT и 14-3-3ζ-Halo должно привести к скорректированным соотношениям BRET 50-60 мБУ (рис. 3A; Дополнительная таблица 1). CRAF содержит два фосфорилированных 14-3-3 стыков…

Discussion

Предыдущие исследования показали, что белки 14-3-3 играют решающую роль как в активации, так и в ингибировании киназ RAF. Понимание того, как регулируются эти события связывания и влияние модуляции этих взаимодействий на передачу сигналов RAF и онкогенез, вызванный RAF, может выявить новые тер…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект был частично профинансирован за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения, под номером ZIA BC 010329.

Materials

Antibodies 
HaloTag® mouse monoclonal antibody Promega G9211  Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody R&D Systems MAB10026 Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)  Santa Crus Biotechnology sc-7267 Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody Amersham NA931-1ML  Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9 Roche/Sigma 6365809001
NanoBRET™ kit  Promega N1661  NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate 
DPBS, without Ca++ and Mg++  Quality Biologicals  114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Life Technologies 25300120
DMEM cell culture media Life Technologies 11995073 High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)   Life Technologies 25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)  Life Technologies   15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media  Gibco 31985062 For cell transfection 
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red Gibco 11058021 For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). 
Invitrogen Trypan Blue Stain  Thermo Scientific  T10282 
NP40 lysis buffer  N/A N/A 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer N/A N/A 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. 
Cell lines 
293FT cells (human) Thermo Scientific  R70007 
DNA vectors 
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant  N/A N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo   N/A N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader PerkinElmer 2104 2104-0010  600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter  Thermo Scientific AMQAX1000 
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor  Thermo Scientific   4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)  GraphPad  www.graphpad.com
Other 
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips  Thermo Scientific  94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile  Thomas Scientific 1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ PerkinElmer 6007680 White, polystyrene, tissue culture treated 
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Scientific  C10228

References

  1. Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
  2. Blasco, M. T., et al. Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF. Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).
  3. Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D). Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).
  4. Lito, P., et al. Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors. Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).
  5. Sanclemente, M., et al. c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling. Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).
  6. Razzaque, M. A., et al. Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome. Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).
  7. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).
  8. Terrell, E. M., Morrison, D. K. Ras-mediated activation of the Raf family kinases. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746 (2019).
  9. Kondo, Y., et al. Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases. Science. 366, 109-115 (2019).
  10. Park, E., et al. Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes. Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).
  11. Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394, 88-92 (1998).
  12. Spencer-Smith, R., et al. RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation. Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).
  13. Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding. Nat Commun. 13, 486 (2022).
  14. Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. The importance of Raf dimerization in cell signaling. Small GTPases. 4, 180-185 (2013).
  15. Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling. Mol Cell. 49, 751-758 (2013).
  16. Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O’Neill, E., Kolch, W. Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization. Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).
  17. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Mol Cell. 20, 963-969 (2005).
  18. Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms. J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).
  19. Chong, H., Guan, K. L. Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction. J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).
  20. Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).
  21. Park, E., et al. Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex. Nat Commun. 14, 4580 (2023).
  22. Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay. STAR Protoc. 4, 102461 (2023).
  23. Clark, G. J., et al. 14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain. J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).
  24. Machleidt, T., et al. NanoBRET–A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).
  25. Hekman, M., et al. Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites. J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).
  26. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, 431-435 (2010).
  27. Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity. Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).
  28. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).
  29. Roy, S., et al. 14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo. Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).
  30. Durrant, D. E., et al. Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction. Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).

Play Video

Cite This Article
Spencer-Smith, R. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells. J. Vis. Exp. (205), e66436, doi:10.3791/66436 (2024).

View Video