在体外使用 邻 苯二甲醛在培养的哺乳动物细胞中快速定量氧化和还原形式的谷胱甘肽

注：以下方案的设计具有与二辛可宁酸（BCA）蛋白测定和腺苷酸激酶（AK）测定结合使用的能力，以使样品标准化为治疗。在整个材料的准备和使用过程中，确保操作员穿着适当的服装和必要的安全设备，例如 Howie 实验室外套、丁腈手套和 I 类安全眼镜。该协议分为几个阶段。 1. 储备液和工作溶液的制备 在1mM HCl中制备100mM GSH标准品的储备溶液（由37%HCl在双蒸水（ddH2O）中制备）。注意： 如果从高浓度酸（例如 37% HCl）稀释，请确保在 I 类通风橱中向水中添加酸的正确过程。 在无水乙醇中制备22.35mM OPA的储备液。在一类通风橱中执行此步骤。在ddH2O中制备25mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）。注意：这三种溶液可以在 -20 °C 下储存长达 3 个月。 制备 0.01 M 三（2-羧乙基）膦 （TCEP） 至总体积为 500 μL，用于 100 孔。制备 100 μL 1 mM GSH 标准品，使用 ddH2O 从 100 mM 原液中稀释。 使用免疫沉淀 （IP） 裂解缓冲液或以下制剂：394 mg Tris-HCl（终浓度 25 mM）、877 mg NaCl（终浓度 150 mM）、29 mg EDTA（终浓度 1 mM）、1 mL 100% NP-40 或 IGEPAL CA-630（终浓度为 1% V/V）、5 mL 甘油（终浓度 5% V/V）、 84 mL ddH2O. 通过轻轻搅拌混合组分并将 pH 调节至 7.4。倒入 100 mL 容量瓶中，加入剩余体积的 ddH2O 以达到最终体积 100 mL。通过0.22μm过滤器的无菌过滤器，并在2-8°C下储存长达6个月。注意：裂解溶液在该测定中确实起到污染物/干扰剂的作用;因此，指定了上述公式。 制备 1 L 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水，补充有乙二胺四乙酸 （PBS-EDTA），浓度为 3 种不同的 pH 值，特别是 7.2、8.5 和 9.0。使用补充有 1 mM EDTA （292.24 mg/L） 或以下 10x （1 L） 配方的商业 0.1 M PBS 缓冲液：80 g NaCl、2.0 g KCl、14.4 g Na2HPO4、2.4 g KH2PO4、800 mL ddH2O。 添加并混合;加满 1 L。 高压灭菌溶液以达到无菌状态，并在室温下储存 12 个月。从10x储备溶液中，制备PBS的工作溶液，并用EDTA（如前所述的浓度）补充。注意：pH 值至关重要;在开始实验方案之前，确保 pH 值准确。 使用 ddH2O（1 mM、500 μM、250 μM、125 μM、62.5 μM、31.25 μM、15.625 μM 和 7.8125 μM）进行 1：2 连续稀释 1 mM GSH。向标准孔中加入每种浓度 10 μL（一式两份）。样品将在裂解缓冲液中进一步稀释;因此，浓度将是其原始浓度的 1/5（200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 μM）。注意：校准的最终浓度为 30 μm、15 μm、7.5 μm、3.75 μm、1.875 μm、937.5 nm、468.8 nm 和 234.4 nm。 2. 测定制备 注：该协议使用人类细胞系HepG2，A549和J774，这些细胞系是从ATCC商业购买的。这些细胞系是根据大学的动物和组织培养法案和条例制定的批准指南使用的。 在测定开始前24小时，以 表1所示的浓度接种细胞;但是，根据所使用的细胞系/类型和处理方式，根据需要调整密度。在具有 10% 热灭活胎牛血清 （HIFS）、1% Penstrep（10,000U/mL 青霉素/10mg/mL 链霉素）和 1% 非必需氨基酸的完全生长培养基（Eagles 改良必需品培养基 （EMEM））中培养细胞。 使用常规细胞接种方法接种细胞32.如果不使用测定后显微镜，则在全黑板中接种细胞。在使用之前，通过显微镜评估 T75 烧瓶中的细胞汇合度和总体健康状况。 在干净、无菌的 II 类生物安全柜中，并遵循严格的无菌技术，丢弃细胞培养基，用 ~15 mL 无菌室温 （RT） PBS 轻轻洗涤细胞，然后丢弃。 向细胞烧瓶中加入5mL无菌1x胰蛋白酶，轻轻摇晃以确保覆盖细胞单层，然后放入37°C的培养箱中5分钟以促进细胞分离。 通过加入含有热灭活胎牛血清 （10%） 的生长培养基（约 10 mL）停止胰蛋白酶消化。 将细胞转移到 50 mL 离心管中，并以 200 x g 沉淀 5 分钟。丢弃培养基并用 5 mL 相同培养基替换。将细胞重悬于试管中，直至均匀且无法观察到结块。 取出 20 μL 细胞悬液并放入血细胞计数器中进行计数。计算出所需的细胞数量后，进行稀释以制备具有正确细胞密度的溶液。 在 96 孔板（容量为 350 μL）中含有细胞的移液器培养基，每孔最大体积为 200 μL。将细胞置于含有5%CO2 的37°C培养箱中24小时以粘附在板表面。 为了评估总谷胱甘肽和GSSG，请处理两种情况的样品。播种和处理 6 个孔，提供 2 套 GSH 和 GSSG，并进行 3 个技术重复（图 1 演示布局）。 确保在检测开始之前适当制备所有试剂;在开始构建缓冲液或在测定中使用之前，确保所有缓冲液组分和试剂均处于室温状态，但 pH 值为 7.4 的 PBS（不含 EDTA）除外，其应保存在冰上/冷藏直至使用。注意：至关重要的是，将气泡的形成限制在最低限度，以允许在测定中发生所需的反应，并允许通过酶标仪进行准确定量。 细胞系 接种密度（96孔板） HepG2 10,000 个细胞/孔 空客A549 5,000 个细胞/孔 J774型 10,000 个细胞/孔 表 1：所选细胞系的建议接种密度。 演示了表示数据中使用的三种不同细胞系的不同接种密度，特别是 A549、J774 和 HepG2。 图 1：用于同时测定总谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物的 96 孔板接种的拟议布局。 此外，还演示了用于校准和控制的孔。未使用的井用十字表示。 请点击这里查看此图的较大版本. 3.纳米材料处理 在具有μg能力的重量秤中称量纳米材料（特别是ZnO，TiO 2，CuO和Ag）。进行计算以达到每种纳米材料 1 mg/mL 的初始浓度。 将纳米材料溶液转移到超声仪中，并使用超声处理浴（38W）超声处理16分钟，以产生均匀的溶液。以 125、62.5、31.25、15.625 μg/mL 对每种纳米材料进行一系列稀释。 从培养箱中取出细胞，并用 RT PBS 轻轻洗涤。在确保所有 PBS 均已去除后，使用对照品（不含 HIFS 的培养基）将 100 μL 处理物加入平板中。对细胞进行处理后，在37°C培养箱（5%CO2）中与纳米材料孵育4小时;然后，使用以下方案量化 GSH：GSSG、蛋白质浓度和 AK 释放。 4. 检测方案 暴露于治疗后（图2A），通过腺苷酸激酶（AK）活性（可选）评估活力。按照制造商的说明使用商业试剂盒进行此测定。 在离心机中以200× g 离心板5分钟，轻轻沉淀处理和细胞碎片（图2B）。 从每个样品和对照孔（如上所述）中轻轻取出 20 μL 培养基上清液，然后以相同的布局格式移液到相邻的 96 孔白板中（图 2C）。 向每个孔中加入 100 μL AK 试剂盒的工作溶液，将板避光，并在室温下发酵 10 分钟。使用酶标仪以 1000 计数/秒的速度记录发光。 对于GSH标准品，向每个孔中加入40μL总谷胱甘肽缓冲液（图2D;可选，定量需要）。 从板中吸出剩余的培养基，并用冰冷的0.1M PBS（pH7.2）洗涤3次，丢弃每次洗涤（图2E），标准品除外。将最后的洗涤液留在板中，直到 GSH 校准液已装入板中。 将 10 μL 每种谷胱甘肽浓度和空白 （ddH2O） 一式三份加入孔中。 取出最终的PBS洗涤液，并按照表2将混合物添加到每个孔中，以获得所需的目标定量（图2E）。在开始此步骤之前计算所需的体积，因为在使用完整缓冲区时，活动会对时间敏感。确保在开始分析过程之前制备这些试剂混合物，但在使用前不要让它们静置超过 30 分钟。 放置在轨道板振荡器上，让板以300RPM振荡2分钟（图2F）。 从振荡器中取出，向每个孔中加入 5 μL 0.01M TCEP 溶液，不包括 NEM 对照孔。将板放回振荡器中并孵育10分钟（图2F）。 将板移至离心机并以200× g 旋转5分钟。将 25 μL 从每个样品孔转移到另一个 96 孔板（透明）;这将用于蛋白质浓缩（参见步骤 4.15 ; 图2G）。请勿转移标准品或测定对照品。 确保每个孔的最终体积为 30 μL;从对照和标准品中去除体积以满足此要求（图2H）。 向每个孔中加入 170 μL 工作 OPA 溶液，将板避光并置于振荡器上 15 分钟（图 2I）。 使用酶标仪在Ex340 / Em450上读取荧光（图2J）。确保在测量阶段不存在气泡;它们将对反应和通过酶标仪进行定量分析产生不利影响。 要定量裂解细胞的蛋白质含量，请使用商业 BCA 检测试剂盒。将从步骤 4.12 中取出的样品以每孔 25 μL 的速度转移到新的 96 孔板（透明）中。 使用在 IP 裂解缓冲液中稀释的牛血清白蛋白 （BSA） 标准品，一式三份加入板中，每孔 25 μL。确切的浓度在 BCA 试剂盒方案中定义。 从 BCA 试剂盒中制备由 50：1 比例的试剂 A 和 B 组成的工作溶液，并向含有样品、标准品和对照品的每个孔中加入 200 μL。屏蔽板避光并在 37°C 下孵育 30 分钟 （图 2K）。 从培养箱中取出样品，在室温下平衡5分钟，然后通过酶标仪在562nm处读取吸光度（图2L）。 总谷胱甘肽浓度裂解试剂混合物 元件 卷 裂解缓冲液 50微升 总体积/孔 50微升 氧化谷胱甘肽浓度裂解试剂混合物 元件 卷 裂解缓冲液 49.5微升 NEM（25毫米） 0.5微升 总体积/孔 50微升 在混合物组成后 30 分钟内使用两种溶液 OPA检测解决方案组件 卷 OPA 3毫克/毫升 5微升 PBS （pH 9.0） 165微升 总体积/孔 170微升 表 2：执行方案所需的试剂体积。 测定总谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物和所需工作试剂所需的每孔体积。确保计算所需的体积，并包含超额，以说明传输过程中的体积损失。 图 2：协议的示意图。 （A） 细胞的初始接种、孵育和处理。（B） 离心以将培养基与悬浮固体分离。（C） 腺苷酸激酶测定的培养基转移。（D） 添加谷胱甘肽浓度用于校准范围。（E） 洗涤阶段和裂解试剂添加。（F）缓冲液加入和三（2-羧乙基）膦加入与振荡步骤。（G） 离心裂解细胞以去除培养基以进行蛋白质分析。（H） 去除介质以平衡整个板的体积。（I） 邻苯二甲醛工作溶液的加入，振荡孵育。（J） 通过酶标仪测量 邻苯二甲醛荧光。（K） 用于蛋白质测定的二辛可宁酸测定的孵育阶段。（L） 测量蛋白质浓度，使谷胱甘肽标准化：谷胱甘肽二硫化物值。 请点击这里查看此图的较大版本.