İn Vitro Kültürlenmiş Memeli Hücrelerinde Orto-ftalaldehit Kullanılarak Oksitlenmiş ve İndirgenmiş Glutatyon Formlarının Hızlı Miktar Tayini

NOT: Aşağıdaki protokol, numuneleri tedavilere normalleştirmek için bir bikinkoninik asit (BCA) protein testi ve bir adenilat kinaz (AK) testi ile birlikte kullanılma kapasitesi ile tasarlanmıştır. Malzemelerin hazırlanması ve kullanımı boyunca operatörün uygun kıyafetler ve Howie laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve sınıf I güvenlik gözlükleri gibi gerekli güvenlik ekipmanlarını giydiğinden emin olun. Protokol birkaç aşamaya ayrılmıştır. 1. Stok ve çalışma solüsyonlarının hazırlanması 1 mM HCl’de 100 mM GSH standardında stok çözeltileri hazırlayın (çift damıtılmış suda (ddH2O)% 37 HCl’den hazırlanır).NOT: HCl gibi yüksek konsantrasyonlu asitten seyreltiliyorsa, sınıf I çeker ocakta suya asit eklemek için doğru işlemi sağlayın. Mutlak etanolde 22.35 mM OPA’lık bir stok hazırlayın. Bu adımı bir sınıf I çeker ocakta gerçekleştirin. ddH 25 O’da 2 mM N-etilmaleimid (NEM) hazırlayın.Bu adımı sınıf I davlumbazda gerçekleştirin.NOT: Bu üç çözelti -20 °C’de 3 aya kadar saklanabilir. 100 kuyu için gerekli olan toplam 500 μL hacme kadar 0.01 M Tris(2-karboksietil) fosfin (TCEP) hazırlayın. ddH2O kullanılarak 100 mM stoktan seyreltilmiş 100 μL 1 mM GSH standardı hazırlayın. İmmünopresipitasyon (IP) lizis tamponu veya aşağıdaki formülasyonu kullanın: 394 mg Tris-HCl (son konsantrasyon 25 mM), 877 mg NaCl (son konsantrasyon 150 mM), 29 mg EDTA (son konsantrasyon 1 mM), 1 mL% 100 NP-40 veya IGEPAL CA-630 (nihai konsantrasyon% 1 V / V), 5 mL gliserol (nihai konsantrasyon% 5 V / V), 84 mL ddH2O. Bileşenleri hafifçe karıştırarak karıştırın ve pH’ı 7.4’e ayarlayın. 100 mL’lik hacimsel bir şişeye boşaltın ve 100 mL’lik bir nihai hacme ulaşmak için kalan ddH2O hacmini ekleyin. 0,22 μm’lik bir filtreden steril filtre geçirin ve 2-8 ° C’de 6 aya kadar saklayın.NOT: Lizasyon çözeltileri bu tahlilde bir kirletici/parazit görevi görür; Bu nedenle, yukarıdaki formülasyonlar belirtilmiştir. Etilendiamin tetraasetik asit (PBS-EDTA) ile desteklenmiş 3 farklı pH değerinde, özellikle 7.2, 8.5 ve 9.0 L 0.1 M fosfat tamponlu salin hazırlayın. 1 mM EDTA (292.24 mg / L) veya aşağıdaki 10x (1 L) formülasyonu ile desteklenmiş ticari bir 0.1 M PBS tamponu kullanın: 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, 800 mL ddH2O ekleyin ve karıştırın; 1 L’ye kadar doldurun Sterilite solüsyonunu otoklavlayın ve oda sıcaklığında 12 ay boyunca saklayın. 10x stok çözeltisinden, çalışan bir PBS çözeltisi yapın ve bunu EDTA (daha önce belirtildiği gibi konsantrasyon) ile destekleyin.NOT: pH kritik öneme sahiptir; Protokole başlamadan önce pH’ın doğru olduğundan emin olun. ddH2O(1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62.5 μM, 31.25 μM, 15.625 μM ve 7.8125 μM) kullanarak 1 mM GSH’nin 1: 2 seri seyreltmesini gerçekleştirin. Standart kuyucuklara her konsantrasyondan 10 μL ekleyin (çift olarak gerçekleştirilir). Numuneler, lizis tamponunda daha da seyreltilecektir; bu nedenle, konsantrasyonlar daha sonra orijinal konsantrasyonlarının 1 /5’i olacaktır (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625 μM).NOT: Kalibrasyon için nihai konsantrasyonlar 30 μm, 15 μm, 7.5 μm, 3.75 μm, 1.875 μm, 937.5 nm, 468.8 nm ve 234.4 nm olacaktır. 2. Tahlil hazırlığı NOT: Bu protokol, ATCC’den ticari olarak satın alınan HepG2, A549 ve J774 insan hücre hatlarını kullanır. Bu hücre hatları, Üniversitenin hayvan ve doku kültürü yasaları ve yönetmelikleri tarafından belirtilen onaylanmış kılavuzlar altında kullanılmıştır. Tahlil başlamadan 24 saat önce, Tablo 1’de gösterilen konsantrasyonlarda tohum hücreleri; Bununla birlikte, kullanılan hücre hattına / tipine ve tedaviye bağlı olarak, yoğunluğu gerektiği gibi ayarlayın. Hücreleri tam büyüme ortamında büyütün (% 10 Isı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (HIFS),% 1 Penstrep (10.000U / mL penisilin / 10mg / mL streptomisin) ve% 1 esansiyel olmayan amino asitler içeren Eagles modifiye edilmiş esansiyel ortam (EMEM). Konvansiyonel hücre tohumlama yöntemleri kullanılarak tohumlanan hücreler32. Tahlil sonrası mikroskopi kullanılmıyorsa tamamen siyah plakalardaki tohum hücreleri. Mikroskopi ile kullanmadan önce T75 şişesindeki hücreleri birleşme ve genel sağlık açısından değerlendirin. Temiz, steril, sınıf II bir biyolojik güvenlik kabininde ve sıkı bir aseptik tekniği izleyerek, hücre ortamını atın, hücreleri ~ 15 mL steril, oda sıcaklığında (RT) PBS ile nazikçe yıkayın ve atın. Hücre şişesine 5 mL steril 1x tripsin ekleyin, hücre tek tabakasının kaplanmasını sağlamak için hafifçe sallayın ve hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için 5 dakika boyunca 37 ° C’de bir inkübatöre yerleştirin. Yaklaşık 10 mL, ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (% 10) içeren büyüme ortamı ekleyerek tripsinizasyonu durdurun. Hücreleri 50 mL’lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g’da pelet yapın. Ortamı atın ve aynı ortamdan 5 mL ile değiştirin. Tüpteki hücreleri homojen olana ve topaklanma gözlenmeyene kadar yeniden süspanse edin. 20 μL hücre süspansiyonunu çıkarın ve saymak için bir hemositometreye yerleştirin. Gerekli hücre sayısı hesaplandıktan sonra, doğru hücre yoğunluğuna sahip bir çözelti yapmak için bir seyreltme gerçekleştirin. Kuyucuk başına maksimum 200 μL hacme sahip 96 oyuklu plakalarda (350 μL kapasiteli) hücreler içeren pipet ortamı. Hücreleri, plaka yüzeyine yapışması için 24 saat boyunca% 5 CO2 içeren 37 ° C’lik bir inkübatöre yerleştirin. Hem toplam glutatyon hem de GSSG’yi değerlendirmek için, her iki durum için de numuneleri tedavi edin. GSH ve GSSG’nin her birine 3 teknik tekrar ile 2 set sağlamak için 6 kuyuyu tohumlayın ve tedavi edin (Şekil 1 yerleşimi göstermektedir). Testin başlamasından önce tüm reaktiflerin uygun şekilde hazırlandığından emin olun; Kullanıma kadar buzda/buzdolabında tutulması gereken pH 7.4 PBS (EDTA olmadan) hariç, tamponların yapımına veya tahlilde kullanıma başlamadan önce tüm tampon bileşenlerinin ve reaktiflerin RT’de olduğundan emin olun.NOT: Test içinde istenen reaksiyonların meydana gelmesine izin vermek ve plaka okuyucu aracılığıyla doğru miktar tayinine izin vermek için kabarcık oluşumunun minimumla sınırlandırılması kritik öneme sahiptir. Hücre hattı Tohumlama yoğunluğu (96 oyuklu plaka) HepG2 10.000 hücre / kuyu A549 Serisi 5.000 hücre / kuyu J774 Serisi 10.000 hücre / kuyu Tablo 1: Seçilen hücre hatları için önerilen tohumlama yoğunlukları. Temsil edilen verilerde kullanılan üç farklı hücre hattı, özellikle A549, J774 ve HepG2 için farklı tohumlama yoğunlukları gösterilmiştir. Şekil 1: Toplam Glutatyon ve Glutatyon disülfidin aynı anda belirlenmesi için 96 kuyulu plakanın tohumlanması için önerilen düzen. Kalibrasyon ve kontroller için kuyular da gösterilmiştir. Kullanılmayan kuyular bir haç ile temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 3. Nanomalzeme tedavisi Nanomalzemeleri (özellikle ZnO, TiO2, CuO ve Ag) μg kapasiteli bir ağırlık ölçeğinde tartın. Nanomalzeme başına 1 mg / mL’lik bir başlangıç konsantrasyonu elde etmek için bir hesaplama yapın. Nanomalzeme çözeltilerini bir sonikatörün içine aktarın ve homojen bir çözelti üretmek için bir sonikasyon banyosu (38 W) kullanarak 16 dakika boyunca sonikat yapın. Her nanomalzeme için 125, 62.5, 31.25, 15.625 μg / mL’de bir dizi seyreltme yapın. Hücreleri inkübatörden çıkarın ve RT PBS ile hafifçe yıkayın. Tüm PBS’nin çıkarıldığından emin olduktan sonra, kontrollerle (HIFS’siz kültür ortamı) plakaya 100 μL tedavi ekleyin. Hücrelere tedavi uyguladıktan sonra, nanomalzemelerle 37 ° C’lik bir inkübatörde (% 5 CO2) 4 saat inkübe edin; daha sonra, GSH’yi ölçmek için aşağıdaki protokolü kullanın: GSSG, protein konsantrasyonu ve AK salınımı. 4. Tahlil protokolü Tedaviye maruz kaldıktan sonra (Şekil 2A), adenilat kinaz (AK) aktivitesi (isteğe bağlı) yoluyla canlılığı değerlendirin. Bu test için üreticinin talimatlarını izleyerek ticari bir kit kullanın. Pelet muamelesini ve hücre kalıntılarını hafifçe temizlemek için plakaları 200 x g’da 5 dakika boyunca bir santrifüjde döndürün (Şekil 2B). Her numuneden 20 μL ortam süpernatantını nazikçe çıkarın ve kontrol kuyusunu (yukarıda belirtildiği gibi) ve aynı yerleşim formatında bitişik 96 oyuklu beyaz bir plakaya pipetleyin (Şekil 2C). AK kitinden her bir oyuğa 100 μL çalışma solüsyonu ekleyin, plakayı ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında 10 dakika gelişmeye bırakın. 1000 sayım/sn’de bir plaka okuyucu kullanarak lüminesansı kaydedin. GSH standartları için, her kuyucuğa 40 μL toplam glutatyon tamponu ekleyin (Şekil 2D; isteğe bağlı, miktar tayini için gereklidir). Plakadan kalan ortamı aspire edin ve 3x’i buz gibi soğuk 0.1 M PBS, pH 7.2 ile yıkayın, standartlar hariç her yıkamayı atın (Şekil 2E). GSH kalibrasyonu plakaya yüklenene kadar son yıkamayı plakada bırakın. Her glutatyon konsantrasyonundan 10 μL ekleyin ve üç kopya halinde kuyucuklara boşaltın (ddH2O). Son PBS yıkamasını çıkarın ve istenen hedef miktar tayini için karışımları Tablo 2’ye göre her bir kuyucuğa ekleyin (Şekil 2E). Tam arabelleklerle zamana duyarlı etkinlik kaybı nedeniyle bu adıma başlamadan önce gerekli hacimleri hesaplayın. Test işlemine başlamadan önce bu reaktif karışımlarının yapıldığından emin olun, ancak kullanmadan önce 30 dakikadan fazla oturmalarına izin vermeyin. Bir orbital plaka çalkalayıcıya yerleştirin ve plakanın 300 RPM’de 2 dakika sallanmasına izin verin (Şekil 2F). Çalkalayıcıdan çıkarın ve NEM kontrol kuyusu hariç her kuyucuğa 5 μL 0.01M TCEP çözeltisi ekleyin. Plakayı çalkalayıcıya geri koyun ve 10 dakika inkübe edin (Şekil 2F). Plakayı santrifüje aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g’da döndürün. Her numune kuyucuğundan 25 μL’yi başka bir 96 oyuklu plakaya (şeffaf) aktarın; Bu, protein konsantrasyonu için kullanılacaktır (bkz. adım 4.15; Şekil 2G). Standartları veya tahlil kontrollerini aktarmayın. Her kuyucuk için son hacmin 30 μL olduğundan emin olun; bu gereksinimi karşılamak için kontrollerden ve standartlardan sesi çıkarın (Şekil 2H). Her kuyucuğa 170 μL çalışma OPA çözeltisi ekleyin, plakayı ışıktan koruyun ve 15 dakika çalkalayıcı üzerine yerleştirin (Şekil 2I). Ex340/EM450’de bir plaka okuyucu kullanarak floresansı okuyun (Şekil 2J). Ölçüm aşamasında kabarcık olmadığından emin olun; Hem reaksiyon hem de plaka okuyucu aracılığıyla miktar tayini üzerinde zararlı bir etkiye sahip olacaklardır. Parçalanmış hücrelerin protein içeriğini ölçmek için ticari bir BCA test kiti kullanın. Adım 4.12’den alınan numuneleri, kuyucuk başına 25 μL’lik yeni bir 96 oyuklu plakaya (şeffaf) aktarın. IP lizis tamponunda seyreltilmiş bir sığır serum albümini (BSA) standardı kullanın ve kuyucuk başına 25 μL’de üç kopya halinde plakaya ekleyin. Kesin konsantrasyonlar BCA kit protokolünde tanımlanmıştır. BCA kitinden 50:1 oranında A ve B reaktiflerinden oluşan bir çalışma solüsyonu hazırlayın ve numune, standart ve kontrol içeren her bir oyuğa 200 μL ekleyin. Plakaları ışıktan koruyun ve 37 ° C’de 30 dakika inkübe edin (Şekil 2K). Numuneleri inkübatörden çıkarın, oda sıcaklığında 5 dakika dengelenmesine izin verin, ardından 562 nm’de plaka okuyucu aracılığıyla absorbasyonu okuyun (Şekil 2L). Toplam glutatyon konsantrasyonu lizis reaktif karışımı Parça Hacim Lizis tamponu 50μL Toplam hacim / kuyu 50μL Oksitlenmiş glutatyon konsantrasyonu lizis reaktif karışımı Parça Hacim Lizis tamponu 49,5 μL NEM (25mM) 0,5μL Toplam hacim / kuyu 50μL HER IKI ÇÖZELTIYI DE KARIŞIM BILEŞIMINDEN 30 DAKIKA SONRA KULLANIN OPA algılama çözümü bileşeni Hacim OPA 3mg / mL 5μL PBS (pH 9.0) 165μL Toplam hacim / kuyu 170μL Tablo 2: Protokolü gerçekleştirmek için gerekli reaktif hacimleri. Toplam glutatyon, glutatyon disülfür ve çalışma reaktifinin belirlenmesi için kuyu başına gereken hacimler gereklidir. Gerekli hacimlerin hesaplandığından ve aktarım yoluyla hacim kaybını hesaba katmak için bir fazlalığın dahil edildiğinden emin olun. Şekil 2: Protokolün şematik gösterimi. (A) Hücrelerin ilk tohumlanması, kuluçka ve tedavisi. (B) Ortamı askıda katı maddelerden ayırmak için santrifüjleme. (C) Adenilat kinaz testi için ortam transferi. (D) Kalibrasyon aralığı için glutatyon konsantrasyonlarının eklenmesi. (E) Yıkama aşamaları ve parçalama reaktifi ilavesi. (F) Tampon ilavesi ve çalkalama adımı ile tris (2-karboksietil) fosfin ilavesi. (G) Protein analizi için ortamın uzaklaştırılması için parçalanmış hücrelerin santrifüjlenmesi. (H) Plaka boyunca hacmi eşitlemek için ortamın çıkarılması. (I) Çalkalama inkübasyonu ile orto-ftalaldehit çalışma solüsyonunun eklenmesi. (J) Orto-ftalaldehit floresansın plaka okuyucu ile ölçülmesi. (K) Protein tayini için Bikinkoninik asit testi için inkübasyon aşamaları. (L) Glutatyonun normalleşmesine izin veren protein konsantrasyonunun ölçümü: glutatyon disülfid değerleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.