In vitro에서 배양된 포유류 세포에서 ortho -phthaldehyde를 사용한 산화 및 환원 형태의 글루타치온의 신속한 정량화
Summary
산화된 글루타치온과 환원된 형태의 글루타치온(각각 GSSG 및 GSH)의 정량화는 오르토프탈알데히드(OPA)를 사용하여 달성되었습니다. OPA는 GSH에 접합되면 고농도 형광성이 되지만 감소될 때까지 GSSG를 접합할 수 없습니다. 여기에서는 정규화를 위해 단백질 정량을 사용하여 두 가지를 모두 정량화하는 다중 파라메트릭 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
글루타치온은 오랫동안 세포의 항산화 반응을 결정하는 핵심 바이오마커로 여겨져 왔습니다. 따라서 활성 산소 종 연구를 위한 주요 마커입니다. 이 방법은 오르토-프탈알데히드( OPA)를 사용하여 글루타치온의 세포 농도를 정량화합니다. OPA는 sulfhydryl 결합을 통해 환원된 글루타치온(GSH)과 접합하여 연속적으로 이소인돌을 형성하여 고형광 접합체를 생성합니다. 산화 글루타치온(GSSG)과 GSH의 정확한 결과를 얻으려면 이 프로토콜에서 구현된 마스킹제와 환원제의 조합이 필요합니다. 치료법은 또한 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 단백질 분석을 통한 정규화가 이 다중 파라미터 분석에서 제시됩니다. 이 분석은 GSH에 특정한 0.234 – 30μM(R2=0.9932±0.007 (N=12))의 의사 선형 검출 범위를 보여줍니다. 제안된 분석법은 또한 환원된 글루타티온과 결합하기 위해 마스킹제 N-에틸말레이미드를 첨가하여 산화된 글루타치온을 측정할 수 있으며, 환원제 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀을 도입하여 GSSG의 이황화물 결합을 절단하여 두 개의 GSH 분자를 생성합니다. 이 분석은 단백질 정량을 위한 검증된 bicinchoninic acid assay 및 세포 독성 평가를 위한 adenylate kinase assay와 함께 사용됩니다.
Introduction
활성산소종(ROS)은 산화 스트레스의 주요 유발 인자입니다. 산화 스트레스는 DNA 돌연변이, 세포 노화/사멸, 다양한 암, 당뇨병, 신경 질환(예: 파킨슨병 및 알츠하이머병) 및 기타 여러 생명을 쇠약하게 하는 질환의 생성에 대해 잘 확립되어 있습니다 1,2,3,4,5. ROS에 대한 주요 방어는 티올산, 비효소 항산화제이며, 이는 양성자 공여체 6,7로 작용하여 산화제 또는 라디칼을 감소시킬 수 있습니다. 글루타치온(GSH)과 시스테인은 포유류에서 발견되는 가장 흔한 두 가지 티올이며, 8 다양한 다른 저분자량 티올(예: 에르고티오네인)이 존재하며, GSH와 시스테인은 문헌9,10,11에서 가장 일반적으로 측정된 비효소 항산화제이며 ROS 8,12,13,14와 싸우는 데 가장 큰 관련성을 가지고 있습니다.
GSH가 산화 방지제로 이용될 때, GSH의 2개의 분자는 이황화물 유대를 통해 함께 공유 결합으로 글루타티온 이황화물 (GSSG)를 만들기 위하여 연결됩니다. GSH의 고갈은 종종 산화 스트레스15,16의 지표로 사용됩니다. GSSG는 세포에서 상대적으로 반응성이 있어 다른 단백질 티올과 이황화물 결합 형성을 유발할 수 있기 때문에 세포에서 GSSG의 증가는 종종 활성 내보내기 프로세스에 의해 제한되지만, 이 평가는 GSSG의 검출과 결합될 수도 있습니다16.
GSH 및 GSSG를 측정하는 기존의 방법은 간단한 공정이 아니며 용해 시약을 사용한 세포 추출을 포함한 수많은 단계가 필요합니다17,18. 여기에 설명된 프로토콜은 이러한 방법을 단순화하고 세포 단백질 함량 또는 아데닐레이트 키나아제 방출을 사용하여 비효소 티올을 정확하게 측정하고 정규화할 수 있도록 합니다. 또한 GSH/GSSG 추출 전에 세포 생존율을 측정할 수 있습니다. 여러 방법은 이전에 환원 및 산화된 비효소 티올을 효율적으로 표적화하고 정량화하려고 시도했습니다. HPLC 19,20,21, 플레이트 분석(생화학적) 22,23,24,25의 사용을 포함한 방법 및 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)(DTNB/Ellman’s reagent)19, Monochlorobimane(mBCI)26,27,28과 같은 티올 접합에 대한 일반적인 시약을 사용합니다.. 몇몇 회사는 또한 글루타티온 검출을 위한 독점 키트를 준비했습니다. 그러나, 그들은 사용된 치료법에 따라 문제를 제기하는 시약 부호환성을 발표하지 않는다29.
이 프로토콜은 오르토-프탈알데히드(OPA) 접합을 통해 환원된 티올(예: GSH)을 검출하여 각각 340/450 Ex/Em에서 검출 가능한 형광 신호를 생성하는 다중 파라메트릭 분석을 간략하게 설명합니다. 이 분석은 마스킹제(N-에틸말레이미드) 및 GSSG 환원제(트리스(2-카르복시에틸) 포스핀)을 사용하여 GSH와 GSSG를 동시에(플레이트에서) 검출할 수 있도록 합니다. 이 다중 바이오마커 프로토콜은 또한 세포 용해 단계에서 최종 측정 완료 시 샘플의 정규화를 위한 bicinchoninic acid assay를 통해 또는 세포 배지의 adenylate kinase assay를 통해 단백질을 정량화할 수 있는 기회를 제공합니다. 이 분석은 대부분의 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 여러 시약을 사용하여 수행할 수 있으며 몇 가지 추가적인 일반적이지 않은 화학 물질만 수행하면 됩니다. 이 프로세스는 간단하고 접근하기 쉬우며 힘든 단계 없이 2시간 이내에 수행할 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 이전에 ROS를 유도하는 것으로 나타났거나 산화 스트레스30,31을 유도하는 것으로 의심되는 다양한 나노 물질이 선택되었습니다. 다양한 세포주에 대한 이러한 나노 물질의 노출 효과와 항산화 티올을 정량화하는 데 있어 분석의 효과를 확인하기 위해 농도 범위를 조사했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
앞서 언급한 바와 같이, 세포 산화 환원을 이해하고, 산화 스트레스 상태를 모니터링하고, 항산화 반응을 모니터링하는 것은 암 및 신경 퇴행과 같은 수많은 질병을 이해하고 예방하는 데 항상 중요했습니다33,34. 여기에서 시연된 것은 빠르고 최소한의 준비로 정확한 GSH: GSSG 검출의 접근성을 높임으로써 중개 환경을 개선하는 수단입니다.
이 프로토콜은 BCA 단백질 분석 및/또는 AK 분석을 통한 2가지 정규화 수단을 사용하여 세포 내 글루타치온/티올 종(환원 및 산화)을 측정하기 위한 다중 파라메트릭 분석 시퀀스를 보여줍니다. 이 분석은 또한 초기 매개체 추출 단계를 통해 다양한 다른 마커를 검출하도록 수정할 수 있으며, 보정 범위를 제외하고 단순히 산화/감소된 티올 비율을 제공하는 방식으로 단순화할 수 있습니다.
분석물질의 평가를 고려할 때 mBCI와 OPA를 모두 탐색하고 사용을 비교했습니다. mBCl은 초기에 우수한 신호 잠재력을 보여주었지만 사용에서 상당한 제한이 발견되었습니다. 주로 살아있는 세포를 사용하는 것이 mBCl을 가장 잘 사용하는 것을 보여줍니다. 그러나, 세포 용해 후에, 신호는 소멸되는 것으로 발견되었고, OPA35에 비해 멀티웰 형식에서 일반적으로 감소된다. 또 다른 문제는 mBCl을 통한 GSSG의 측정인데, 이에 대한 문헌이 부족하고 프로토콜 최적화/탐색을 통해 mBCl을 통한 GSSG의 정확한 감지가 이루어지지 않았습니다.
OPA 분석은 0.234 – 30 μM GSH 농도 범위에서 R2 평균 0.9932 ± 0.007 (N=12)로 상당히 신뢰할 수 있는 보정 범위를 제공한다는 것을 입증했습니다. 이 범위는 문헌35에서 발견되는 이전 참조 범위로 인해 선택되었습니다. 이론적으로 이러한 범위를 벗어난 글루타치온을 검출하는 것이 가능하지만 시약의 농도, 배양 시간 및 검출에 사용되는 장비를 수정해야 할 수 있습니다. 각 플레이트에는 정량화를 위해 자체 표준 범위가 필요하다는 점에 유의해야 합니다. 다른 날에 수행된 플레이트 간의 약간의 시간 차이는 측정 중에 얻은 값에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
이 프로토콜에서 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 얻는 것은 몇 가지 중요한 단계를 엄격하게 준수하는 데 달려 있습니다. 프로토콜에 필요한 다양한 버퍼를 구성할 때 pH가 정확해야 합니다. 따라서 pH 9를 요구하는 완충액은 이 값의 ± 0.1을 초과하는 편차가 없어야 합니다. 이는 버퍼 성분이 잘못된 pH에서 용액 밖으로 침전될 가능성이 있기 때문입니다. 이 프로토콜을 정확히 따르면 이 문제를 방지할 수 있습니다.
처리를 완전히 제거하고 용해하기 전에 정확한 세척을 하는 것도 플레이트 판독 단계에서 아티팩트와 부정확한 데이터 획득을 방지하는 데 중요합니다. 세포가 용해되면(단계 4.8) 처리를 제거할 수 없으며 플레이트를 회수할 수 없습니다. 프로토콜 전체에 추가되는 완충액/시약의 부피가 샘플과 표준물질 간에 다르기 때문에 사용자가 4.12 및 4.13 단계에서 다양한 부피를 인식하는 것이 중요합니다. 또한 분석 작업자는 이러한 다양한 부피를 인식하고 정확한 측정을 달성할 수 있도록 모든 부피가 동일한지 확인하도록 지시받습니다. 샘플과 표준물질 사이의 부피가 눈에 띄게 크지 않기 때문에 샘플 웰에 과도한 용액이 있는 것과 관련하여 쉽게 실수를 저지를 수 있습니다.
이 프로토콜에는 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 획득하는 데 중요한 단계에 의존하는 제한 사항이 있습니다. 이 분석을 수행하는 사용자는 기포 형성과 같은 원치 않는 문제를 방지하기 위해 합리적인 수준의 실험실 기술을 보유해야 합니다. 기포 형성은 마이크로플레이트 내에서 반응이 발생하는 용량과 형광 측정 모두에 큰 영향을 미칩니다. 이 프로토콜에 사용된 용해제에는 세제가 포함되어 있어 기포 형성을 방지하는 데 어려움을 겪을 수 있는 초보 연구자에게는 어려움을 겪을 수 있습니다. 즉각적인 원심 분리로 이 오류를 복구할 수 있습니다. 프로토콜은 또한 세포 유형과 관련하여 잠재적으로 제한됩니다. 세포주 A549, J774 및 HepG2는 이 프로토콜에 대한 데이터를 최적화하고 생성하는 데 활용되었습니다. 다른 세포주는 정확한 데이터를 얻기 위해 다른 seeding 밀도와 프로토콜의 최적화가 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜은 여러 기존 분석에 비해 많은 이점을 제공합니다. 프탈알데히드를 사용한 티올 검출이 새로운 개념은 아니지만, 필요한 재료와 장비가 제한된 마이크로플레이트에서 이와 같은 결합 분석 형식으로 활용하면 모든 실험실에서 이 프로토콜에 액세스할 수 있는 큰 잠재력을 얻을 수 있습니다. 상업 공급업체의 대부분의 Thiol/GSH 키트는 시약의 구성을 공개하지 않습니다. 따라서 비호환성/간섭의 가능성을 예측하기 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이러한 잠재력을 제한하기 위해 사용되는 모든 시약의 각 구성 요소를 제시합니다.
이 프로토콜은 또한 초기 치료 기간이 완료되면 다소 빠르게 수행됩니다. 배양 단계 사이의 사용자 처리를 고려하면 이 프로토콜의 티올 정량 측면은 1시간 이내에 수행할 수 있습니다. 시료는 동시에 용해되고 결합되어 시료의 자동 산화를 방지하며, 이는 이러한 반응 종에 최적입니다. 프로토콜에 명시되어 있지는 않지만, 샘플은 기술적으로 플레이트에 용해되고 밀봉될 수 있으므로 향후 분석을 위해 동결할 수 있습니다. 그러나 프로토콜에 대한 이러한 변경은 검토되지 않았습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 유럽 프로젝트인 GRACIOUS(GA760840)와 SUNSHINE(GA952924)의 지원을 받았습니다. 저자들은 또한 이 프로토콜의 개발에 어떤 식으로든 도움을 준 모든 사람들의 노력에 감사를 표하고 싶습니다.
Materials
| 0.22µm filter (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 12561259 | |
| 100mL volumetric flask | Fisher scientific | 15290866 | |
| 1L Volumetric flask | Fisher scientific | 15230876 | |
| 250mL beaker (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 15409083 | |
| 8-Channel micropipette (20-200µL) | SLS | FA10011D2 | |
| 8-Channel micropipette (2-20µL) | SLS | B2B06492 | |
| 96 well plates – black with clear bottom, TC treated | Fisher scientific | 10000631 | Preferred plate for seeding and fluoresence, use TC treated clear if unavailable |
| 96 well plates – clear (TC treated and untreated) | Fisher scientific | 10141161 | If black plates with clear bottom is not available/ suitable use TC treated clear |
| 96 well plates – white, Not TC treated | Fisher scientific | 11457009 | |
| A549 (lung carcinoma) cell line | ATCC | CCL-185 | |
| Absolute ethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 1.08543 | |
| Aluminium foil | Fisher scientific | 11779408 | For protecting plates from light |
| BCA Assay Kit | Thermo | 23225 | |
| Benchtop Centrifuge (with 96 plate rotor) | Eppendorf | 5804 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck (Sigma-Aldrich) | E9884 | |
| Glutathione (GSH) | Merck (Sigma-Aldrich) | G6013 | |
| Glutathione disulfide (GSSG) | Merck (Sigma-Aldrich) | G4501 | |
| Glycerol | Merck (Sigma-Aldrich) | G5516 | |
| HCl, 37% | Merck (Sigma-Aldrich) | 258148 | Dilute to 1mM for GSH stock, pH adjustment also |
| HepG2 (Hepatocarcinoma) cell line | ATCC | HB-8065 | |
| IGEPAL CA-630 | Merck (Sigma-Aldrich) | 18896 | Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both |
| IP lysis buffer | Fisher scientific | 11825135 | |
| J774 (monocyte, macrophage) cell line | ATCC | TIB-67 | |
| KCl | Merck (Sigma-Aldrich) | P3911 | |
| KH2PO4 | Merck (Sigma-Aldrich) | P0662 | |
| Micropipette (20-200µL) | SLS | B2B06482 | |
| Micropipette (2-20µL) | SLS | B2B06478 | |
| Microplate shaker | VWR | 444-0041 | |
| Na2HPO4 | Merck (Sigma-Aldrich) | S9763 | |
| NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S9888 | |
| NaOH, 10M | Merck (Sigma-Aldrich) | 72068 | For pH adjustment only |
| N-Ethylmaleimide (NEM) | Merck (Sigma-Aldrich) | E3876 | |
| NP-40 | Merck (Sigma-Aldrich) | 492016 | Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both. NP-40 alternative suggested |
| Ortho -Phthaldialdehyde (OPA) | Merck (Sigma-Aldrich) | P1378 | |
| PBS 0.1M | Merck (Sigma-Aldrich) | P2272 | PBS can either be acquired pre-made or made in house, see notes |
| Plate reader (with fluoresence capacity) | Tecan | SPARK | |
| Stir bar (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 16265731 | |
| Toxilight bioassay kit (AK assay) | Lonza | LT17-217 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) 0.5M in H2O | Alfa Aesar | H51864 | Can also be purchased crystalised and suspended |
| TRIS-HCl | Merck (Sigma-Aldrich) | 93363 | |
| X100 phosphatase and protease cocktail | Fisher scientific | 10025743 |
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