Cuantificación rápida de formas oxidadas y reducidas de glutatión utilizando orto-ftalaldehído en células de mamífero cultivadas in vitro

NOTA: El siguiente protocolo ha sido diseñado con la capacidad de ser utilizado junto con un ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) y un ensayo de adenilato quinasa (AK) para normalizar las muestras a los tratamientos. Asegúrese de que el operador use la vestimenta adecuada y el equipo de seguridad necesario, como una bata de laboratorio Howie, guantes de nitrilo y gafas de seguridad de clase I, durante la preparación y el uso de los materiales. El protocolo se divide en varias etapas. 1. Preparación de existencias y soluciones de trabajo Prepare soluciones madre de 100 mM GSH estándar en 1 mM de HCl (preparadas a partir de 37% de HCl en agua bidestilada (ddH2O)).NOTA: Si diluye a partir de ácido altamente concentrado, como HCl al 37%, asegúrese de que el proceso correcto de adición de ácido al agua en una campana extractora de clase I. Prepare un stock de 22,35 mM de OPA en etanol absoluto. Realice este paso en una campana extractora de clase I. Prepare 25 mM de N-etilmaleimida (NEM) en ddH2O. Realice este paso en una campana extractora de clase I.NOTA: Estas tres soluciones pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 3 meses. Prepare 0,01 M de Tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP) a un volumen total de 500 μL, necesario para 100 pocillos. Prepare 100 μL de 1 mM de patrón GSH, diluido a partir de 100 mM de caldo utilizando ddH2O. Utilice tampón de lisis de inmunoprecipitación (IP) o la siguiente formulación: 394 mg de Tris-HCl (concentración final de 25 mM), 877 mg de NaCl (concentración final de 150 mM), 29 mg de EDTA (concentración final de 1 mM), 1 mL de NP-40 al 100% o IGEPAL CA-630 (concentración final de 1% V/V), 5 mL de glicerol (concentración final de 5% V/V), 84 mL de ddH2O. Mezcle los componentes agitando suavemente y ajuste el pH a 7,4. Decantar en un matraz aforado de 100 mL y añadir el volumen restante de ddH2O hasta alcanzar un volumen final de 100 mL. Filtre estérilmente a través de un filtro de 0,22 μm y almacene a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.NOTA: Las soluciones de lisación actúan como contaminantes/interferentes en este ensayo; Por lo tanto, se especifican las formulaciones anteriores. Prepare 1 L de solución salina tamponada con fosfato 0,1 M suplementada con ácido etilendiaminotetraacético (PBS-EDTA) a 3 valores de pH diferentes, concretamente 7,2, 8,5 y 9,0. Utilice un tampón comercial de 0,1 M de PBS suplementado con 1 mM de EDTA (292,24 mg/L) o la siguiente formulación de 10x (1 L): 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4, 800 mL de ddH2O. Añadir y mezclar; rellene hasta 1 L. Esterilizar en autoclave la solución para la esterilidad y almacenarla durante 12 meses a temperatura ambiente. A partir de la solución madre 10x, haga una solución de trabajo de PBS y compleméntela con EDTA (concentración como se indicó anteriormente).NOTA: El pH es de vital importancia; asegúrese de que el pH sea preciso antes de comenzar el protocolo. Realice una dilución en serie 1:2 de 1 mM de GSH utilizando ddH2O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM, 15,625 μM y 7,8125 μM). Añadir 10 μL de cada concentración a los pocillos estándar (realizado por duplicado). Las muestras se diluirán aún más en tampón de lisis; por lo tanto, las concentraciones serán 1/5 de su concentración original después (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625 μM).NOTA: Las concentraciones finales para la calibración serán 30 μm, 15 μm, 7,5 μm, 3,75 μm, 1,875 μm, 937,5 nm, 468,8 nm y 234,4 nm. 2. Preparación del ensayo NOTA: Este protocolo utiliza las líneas celulares humanas HepG2, A549 y J774, que se compraron comercialmente a ATCC. Estas líneas celulares se utilizaron bajo las pautas aprobadas descritas por las leyes y regulaciones de cultivo de animales y tejidos de la Universidad. A las 24 horas anteriores al inicio del ensayo, las células de siembra en las concentraciones indicadas en la Tabla 1; Sin embargo, dependiendo de la línea celular/tipo y tratamiento utilizado, ajuste la densidad según sea necesario. Cultive células en un medio de crecimiento completo (medio esencial modificado Eagles (EMEM) con 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor (HIFS), 1% de Penstrep (10,000 U/mL de penicilina/10 mg/mL de estreptomicina) y 1 % de aminoácidos no esenciales. Células de siembra utilizando métodos convencionales de siembra celular32. Células de semilla en placas completamente negras si no se utiliza microscopía posterior al ensayo. Evalúe la confluencia y el estado general de las células en el matraz T75 antes de usarlo mediante microscopía. En una cabina de seguridad biológica limpia, estéril y de clase II y siguiendo una estricta técnica aséptica, deseche los medios celulares, lave suavemente las células con ~ 15 ml de PBS estéril a temperatura ambiente (RT) y deséchelo. Al matraz de células, agregue 5 mL de tripsina estéril 1x, balancee suavemente para asegurar la cobertura de la monocapa celular y colóquelo en una incubadora a 37 °C durante 5 min para facilitar el desprendimiento de las células. Detener la tripsinización mediante la adición de un medio de crecimiento que contenga suero de ternero fetal inactivado por calor (10%), aproximadamente 10 mL. Transfiera las celdas a un tubo de centrífuga de 50 mL y granule a 200 x g durante 5 min. Deseche el medio y reemplácelo con 5 ml del mismo medio. Vuelva a suspender las células en el tubo hasta que estén homogéneas y no se puedan observar aglomeraciones. Retire 20 μL de suspensión celular y colóquelos en un hemocitómetro para el recuento. Una vez que se haya calculado el número de celdas requeridas, realice una dilución para hacer una solución con la densidad celular correcta. Medios de pipeta que contienen celdas en placas de 96 pocillos (350 μL de capacidad), con un volumen máximo de 200 μL por pocillo. Coloque las células en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h para que se adhieran a la superficie de la placa. Para evaluar tanto el glutatión total como el GSSG, trate las muestras para ambas afecciones. Siembre y trate 6 pocillos para proporcionar 2 juegos de GSH y GSSG con 3 repeticiones técnicas (la Figura 1 muestra el diseño). Asegúrese de que todos los reactivos estén debidamente preparados antes del comienzo del ensayo; asegúrese de que todos los componentes y reactivos del tampón estén en RT antes de comenzar la construcción de tampones o su uso en el ensayo, con la excepción de pH 7,4 PBS (sin EDTA), que debe mantenerse en hielo/refrigerado hasta su uso.NOTA: Es de vital importancia que la formación de burbujas se limite al mínimo para permitir que ocurran las reacciones deseadas dentro del ensayo y permitir una cuantificación precisa a través del lector de placas. Línea celular Densidad de siembra (placa de 96 pocillos) HepG2 10.000 células/pocillo A549 5.000 celdas / pozo J774 10.000 células/pocillo Tabla 1: Densidades de siembra sugeridas para las líneas celulares elegidas. Se demuestran diferentes densidades de siembra para tres líneas celulares diferentes utilizadas en los datos representados, específicamente A549, J774 y HepG2. Figura 1: Diseño propuesto para la siembra de placas de 96 pocillos para la determinación simultánea de glutatión total y disulfuro de glutatión. También se muestran pozos para calibración y controles. Los pozos que no se utilizan se representan con una cruz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Tratamiento de nanomateriales Pesa nanomateriales (específicamente ZnO, TiO2, CuO y Ag) en una báscula con capacidad de μg. Realizar un cálculo para alcanzar una concentración inicial de 1 mg/mL por nanomaterial. Transfiera las soluciones de nanomateriales a un sonicador y sonique durante 16 minutos utilizando un baño de sonicación (38 W) para producir una solución homogénea. Realizar una serie de diluciones para cada nanomaterial a 125, 62,5, 31,25, 15,625 μg/mL. Retire las células de la incubadora y lávelas ligeramente con RT PBS. Después de asegurarse de que se ha eliminado todo el PBS, agregue 100 μL de tratamientos a la placa, con controles (medios de cultivo sin HIFS). Después de aplicar el tratamiento a las células, incubar con los nanomateriales en una incubadora a 37 °C (5% CO2) durante 4 h; A continuación, utilice el siguiente protocolo para cuantificar GSH: GSSG, concentración de proteínas y liberación de AK. 4. Protocolo de ensayo Después de la exposición al tratamiento (Figura 2A), evaluar la viabilidad a través de la actividad de la adenilato quinasa (AK) (opcional). Utilice un kit comercial para este ensayo siguiendo las instrucciones del fabricante. Centrifugar las placas en una centrífuga a 200 x g durante 5 min para tratar ligeramente los pellets y los restos celulares (Figura 2B). Retire suavemente 20 μL de sobrenadante de medio de cada pocillo de muestra y control (como se especificó anteriormente) y pipetee en una placa blanca adyacente de 96 pocillos en el mismo formato de diseño (Figura 2C). Añada 100 μL de solución de trabajo del kit AK a cada pocillo, proteja la placa de la luz y deje actuar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Registre la luminiscencia utilizando un lector de placas a 1000 cuentas/s. Para los estándares de GSH, agregue 40 μL de tampón de glutatión total a cada pocillo (Figura 2D; opcional, requerido para la cuantificación). Aspire el medio restante de la placa y lave 3 veces con PBS 0.1 M helado, pH 7.2, desechando cada lavado (Figura 2E) con la excepción de los estándares. Deje el lavado final en la placa hasta que la calibración GSH se haya cargado en la placa. Añadir 10 μL de cada concentración de glutatión y blanco (ddH2O) en los pocillos por triplicado. Retire el lavado final de PBS y agregue las mezclas a cada pocillo según la Tabla 2 para la cuantificación objetivo deseada (Figura 2E). Calcule los volúmenes necesarios antes de comenzar este paso debido a la pérdida de actividad urgente con búferes completos. Asegúrese de preparar estas mezclas de reactivos antes de comenzar el proceso de ensayo, pero no permita que se asienten durante más de 30 minutos antes de su uso. Colóquelo en un agitador de placas orbital y deje que la placa se agite a 300 RPM durante 2 minutos (Figura 2F). Retirar del agitador y añadir 5 μL de solución de TCEP 0,01M a cada pocillo, excluyendo el pocillo de control NEM. Regrese la placa al agitador e incube durante 10 minutos (Figura 2F). Transfiera la placa a la centrífuga y centrifuga a 200 x g durante 5 min. Transfiera 25 μL de cada pocillo de muestra a otra placa de 96 pocillos (transparente); Esto se utilizará para la concentración de proteínas (ver Paso 4.15 ; Figura 2G). No transfiera patrones ni controles de ensayo. Asegúrese de que el volumen final de cada pocillo sea de 30 μL; eliminar el volumen de los controles y estándares para cumplir con este requisito (Figura 2H). Agregue 170 μL de solución de OPA funcional a cada pocillo, proteja la placa de la luz y colóquela en el agitador durante 15 minutos (Figura 2I). Lea la fluorescencia usando un lector de placas en Ex340/EM450 (Figura 2J). Asegúrese de que no haya burbujas durante la etapa de medición; Tendrán un impacto perjudicial tanto en la reacción como en la cuantificación a través del lector de placas. Para cuantificar el contenido de proteínas de las células lisadas, utilice un kit de ensayo comercial de BCA. Transfiera las muestras tomadas del paso 4.12 a una nueva placa de 96 pocillos (transparente) a 25 μL por pocillo. Utilice un patrón de albúmina sérica bovina (BSA) diluido en tampón de lisis IP y añádalo a la placa por triplicado a 25 μL por pocillo. Las concentraciones exactas se definen en el protocolo del kit BCA. Prepare una solución de trabajo que consista en una proporción de 50:1 de los reactivos A y B del kit de BCA y agregue 200 μL a cada pocillo que contenga la muestra, el patrón y el control. Proteja las placas de la luz e incube a 37 °C durante 30 minutos (Figura 2K). Retire las muestras de la incubadora, deje que se equilibren a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego lea la absorbancia a través del lector de placas a 562 nm (Figura 2L). Concentración total de glutatión Mezcla de reactivos de lisis Componente Volumen Tampón de lisis 50 μL Volumen total / pozo 50 μL Mezcla de reactivos de lisis con concentración de glutatión oxidado Componente Volumen Tampón de lisis 49,5 μL NEM (25mM) 0,5 μL Volumen total / pozo 50 μL USE AMBAS SOLUCIONES DENTRO DE LOS 30 MINUTOS POSTERIORES A LA COMPOSICIÓN DE LA MEZCLA Componente de la solución de detección OPA Volumen OPA 3 mg/mL 5μL PBS (pH 9.0) 165 μL Volumen total / pozo 170 μL Tabla 2: Volúmenes necesarios de reactivos para la realización del protocolo. Volúmenes requeridos por pocillo para la determinación de glutatión total, disulfuro de glutatión y reactivo de trabajo requeridos. Asegúrese de que se calculan los volúmenes necesarios y de que se incluya un exceso para tener en cuenta la pérdida de volumen a través de la transferencia. Figura 2: Representación esquemática del protocolo. (A) Siembra inicial, incubación y tratamiento de las células. (B) Centrifugación para separar los medios de los sólidos en suspensión. (C) Transferencia de medios para el ensayo de adenilato quinasa. (D) Adición de concentraciones de glutatión para el rango de calibración. (E) Etapas de lavado y adición de reactivos de lisación. (F) Adición de tampón y adición de fosfina tris (2-carboxietilo) con paso de agitación. (G) Centrifugación de células lisadas para la eliminación de medios para el análisis de proteínas. (H) Eliminación de medios para igualar el volumen a través de la placa. (I) Adición de solución de trabajo de ortoftalaldehído con incubación por agitación. (J) Medición de la fluorescencia del ortoftalaldehído mediante lector de placas. (K) Etapas de incubación para el ensayo de ácido bicinconínico para la determinación de proteínas. (L) Medición de la concentración de proteínas, permitiendo la normalización del glutatión: valores de disulfuro de glutatión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.