Summary

Differenzierung der Abstammungslinien des enterischen Nervensystems von humanen pluripotenten Stammzellen

Published: May 17, 2024
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Summary

Die Ableitung von Abstammungslinien des enterischen Nervensystems (ENS) aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) bietet eine skalierbare Zellquelle zur Untersuchung der ENS-Entwicklung und -Krankheit sowie zur Verwendung in der regenerativen Medizin. Hier wird ein detailliertes in vitro Protokoll zur Gewinnung enterischer Neuronen aus hPSCs unter chemisch definierten Kulturbedingungen vorgestellt.

Abstract

Das menschliche enterische Nervensystem (ENS) ist ein großes Netzwerk von glialen und neuronalen Zelltypen mit einer bemerkenswerten Vielfalt an Neurotransmittern. Das ENS steuert die Darmmotilität, die Enzymsekretion und die Nährstoffaufnahme und interagiert mit dem Immunsystem und dem Darmmikrobiom. Folglich sind entwicklungsbedingte und erworbene Defekte des ENS für viele menschliche Krankheiten verantwortlich und können zu Symptomen der Parkinson-Krankheit beitragen. Einschränkungen bei Tiermodellsystemen und beim Zugang zu primärem Gewebe stellen bei Studien des humanen ENS eine erhebliche experimentelle Herausforderung dar. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für eine effektive in vitro Gewinnung der ENS-Linien aus humanen pluripotenten Stammzellen, hPSC, unter definierten Kulturbedingungen vorgestellt. Unser Protokoll beginnt mit der gerichteten Differenzierung von hPSCs zu enterischen Neuralleistenzellen innerhalb von 15 Tagen und liefert innerhalb von 30 Tagen verschiedene Subtypen von funktionellen enterischen Neuronen. Diese Plattform bietet eine skalierbare Ressource für Entwicklungsstudien, Krankheitsmodellierung, Wirkstoffforschung und regenerative Anwendungen.

Introduction

Das enterische Nervensystem (ENS) ist der größte Bestandteil des peripheren Nervensystems. Das ENS enthält mehr als 400 Millionen Neuronen, die sich im Magen-Darm-Trakt befinden und fast alle Funktionen des Darms steuern1. Das molekulare Verständnis der Entwicklung und Funktion des ENS und seiner Defekte bei enterischen Neuropathien erfordert den Zugang zu einer zuverlässigen und authentischen Quelle für enterische Neuronen. Der Zugang zu menschlichem Primärgewebe ist begrenzt, und Tiermodelle können die wichtigsten Krankheitsphänotypen bei vielen enterischen Neuropathien nicht rekapitulieren. Die Technologie der humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) hat sich als äußerst vorteilhaft erwiesen, da sie eine unbegrenzte Quelle für die gewünschten Zelltypen bietet, insbesondere für solche, die nur schwer aus Primärquellen isoliert werden können 2,3,4,5,6,7. Im Folgenden stellen wir Ihnen eine schrittweise und robuste In-vitro-Methode zur Gewinnung von ENS-Kulturen aus hPS-Zellen vor. Diese skalierbaren hPSC-abgeleiteten Kulturen eröffnen Wege für Entwicklungsstudien, Krankheitsmodellierung und Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und können transplantierbare Zellen für die regenerative Medizin bereitstellen.

Die enterischen Neuronenlinien stammen von Neuralleistenzellen (NC) ab, die während der Embryogenese dem ENS-Entwicklungspfad folgen. In Embryonen entstehen NC-Zellen entlang der Ränder der gefalteten Neuralplatte. Sie vermehren sich, wandern und führen zu vielen verschiedenen Zelltypen, darunter sensorische Neuronen, Schwann-Zellen, Melanozyten, kraniofaziale Skelett- und enterische Neuronen sowie Gliazellen 8,9,10. Die Entscheidung über das Zellschicksal hängt von der unterschiedlichen Region entlang der anterior-posterioren Achse ab, aus der die NC-Zellen hervorgehen, d.h. kraniale NC, vagale NC, Rumpf-NC und sakrale NC. Das ENS entwickelt sich aus vagalen und sakralen NC-Zellen, wobei erstere aufgrund der ausgedehnten Wanderung entlang des Darms und der Besiedlung des Darms die Population der enterischen Neuronen dominieren11.

Die Ableitung von NC-Zellen aus PSCs beinhaltet üblicherweise eine Kombination aus dualer SMAD-Hemmung und Aktivierung des WNT-Signalwegs12,13. Bis vor kurzem wurden bei allen NC-Induktionsprotokollen Serum und andere tierische Produktzusätze unter den Kulturbedingungen verwendet. Chemisch undefinierte Medien verringern nicht nur die Reproduzierbarkeit der NC-Induktion, sondern stellen auch eine Herausforderung für mechanistische Entwicklungsstudien dar. Um diese Herausforderungen zu meistern, entwickelten Barber et al.14 ein NC-Induktionsprotokoll unter chemisch definierten Kulturbedingungen und waren daher gegenüber alternativen Methoden, die auf Serumersatzfaktoren (z. B. KSR) basieren, vorteilhaft13,14. Dies wurde durch den Ersatz von Basalmedien und die Optimierung eines ursprünglich von Fattahi et al. vorgestellten Protokolls zur Ableitung enterischer NC-Zellen aus hPSCs erreicht. Dieses verbesserte System ist die Grundlage des hier vorgestellten hPSC-Differenzierungsprotokolls. Sie beginnt mit der Induktion von enterischen Neuralleistenzellen (ENC) in einem Zeitraum von 15 Tagen durch präzise Modulation der BMP-, FGF-, WNT- und TGFβ-Signalwege zusätzlich zu Retinsäure (RA). Anschließend leiten wir die ENS-Linien ab, indem wir Zellen mit dem von Gliazelllinien abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) behandeln. Alle Medienzusammensetzungen sind chemisch definiert und liefern innerhalb von 30-40 Tagen robuste enterische neuronale Kulturen.

Zusätzlich zu dem hier beschriebenen Monolayer-Zellkultursystem wurden alternative NC-Induktionsansätze entwickelt, die frei schwebende Embryoidkörper verwenden15,16. Es wurde gezeigt, dass wandernde Zellen in diesen Kulturen NC-Marker exprimieren, wobei eine Untergruppe die vagale NC repräsentiert. Co-Kulturen mit primärem Darmgewebe wurden verwendet, um enterische NC-Vorläufer in diesen Kulturen anzureichern. Die Medienzusammensetzungen in diesen Studien enthalten eine Kombination verschiedener Faktoren wie Nervenwachstumsfaktor, NT3 und vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor. Zu diesem Zeitpunkt ist noch nicht vollständig klar, wie sich diese Faktoren auf die Bindungsidentitäten der enterischen Neuronen auswirken könnten. Für einen effizienten Vergleich der enterischen NC-Induktion in der Monoschicht und den Embryoidkörper-basierten Kulturen sind weitere Daten erforderlich. Angesichts der unterschiedlichen Kulturlayouts in diesen Strategien sollte der Einsatz jeder Methode in Betracht gezogen und entsprechend der spezifischen Anwendung optimiert werden.

Das hier vorgestellte Protokoll ist reproduzierbar und wurde von uns und anderen erfolgreich mit verschiedenen hPSC-Linien (induziert und embryonal) getestet 8,14,16.

Protocol

1. Vorbereitung der Medien HINWEIS: Bei den im Protokoll genannten Konzentrationen handelt es sich um Endkonzentrationen der Medienkomponenten. Bereiten Sie alle Medien unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube vor und lagern Sie sie bei 4 °C im Dunkeln. Innerhalb von 2 Wochen verbrauchen. hPSC-Erhaltungsmedium: Mischen Sie das zuführfreie hPSC-Erhaltungsmedium (20 μl/ml) mit dem Basismedium. Medium A: Geben Sie das knochenmorphogenetische P…

Representative Results

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Ableitung der enterischen Neuralleiste und enterischer Neuronen aus hPSCs unter Verwendung chemisch definierter Kulturbedingungen (Abbildung 1A-B). Die Erzeugung hochwertiger Neuronen hängt von einem effizienten Induktionsschritt der enterischen Neuralleiste ab. Dies kann visuell beurteilt werden, indem die Morphologie der frei schwebenden Kugeln überprüft wird, die mit glatten Oberflächen mit einer Größe von etwa 0,1 – 0,4 mm r…

Discussion

Das hier beschriebene Differenzierungsprotokoll bietet eine robuste in vitro-Methode, um enterische Neuronen aus hPSCs innerhalb von 30-40 Tagen (Abbildung 1E) und enterische Gliazellen, die das saure Gliaprotein, GFAP und SOX10 exprimieren, in älteren Kulturen zu erhalten (> Tag 55)13,14,19,22. Diese Neuronen und Gliazellen werden durch schrittweise Diff…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse des UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research und der Sandler Foundation, March of Dimes Grant Nr. 1-FY18-394 und 1DP2NS116769-01, den NIH Director’s New Innovator Award (DP2NS116769) an F.F. und das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK121169) an F.F., H.M. wird unterstützt durch das Postdoktorandenstipendium der Larry L. Hillblom Foundation, NIH T32-DK007418-Stipendium und UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research unabhängiges Postdoc-Stipendium.

Materials

Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A) Gibco 12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex Gibco A14133-2
BMP4 R&D systems 314-BP
Cell culture centrifuge Eppendorf, model no. 5810R 02262501
Cell detachment solution, Accutase Stemcell Technologies 07920
CHIR99021 Tocris 4423
Conical tubes USA scientific 1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6 Life Technologies A1516401
DMEM/F-12 no glutamine Life Technologies 21331020
EDTA Corning MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit Life Technologies A2858501
FGF2 R&D systems 233-FB/CF
Fibronectin Corning 356008
GDNF Peprotech 450-10
Hemocytometer Hausser Scientific 1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC WiCell RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 Thermo Fisher Scientific Herralcell 150i
Inverted microscope Thermo Fisher Scientific EVOS FL
Laminar flow hood Thermo Fisher Scientific 1300 series class II, type A2
Laminin Cultrex 3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro Corning 25-015-CI
MEM NEAAs Corning 25-025-CI
Multiwell plates, Falcon BD 353934, 353075
N-2 Supplement CTS A1370701
Neurobasal Medium Life Technologies 21103049
PBS (Ca and Mg free) Life Technologies 10010023
Pipette filler Eppendorf Z768715-1EA
Pipette tips USA scientific 1111-2830
Pipettes Fisherbrand 13-678-11E, 13-678-11F
PO Sigma-Aldrich P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi ibidi 81156
RA Sigma-Aldrich R2625
SB431542 R&D systems 1614
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250-061
Ultra-low attachment plates Fisher Scientific 07-200-601
Y-27632 dihydrochloride R&D systems 1254

References

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Majd, H., Richter, M. N., Samuel, R. M., Kalantari, A., Ramirez, J. T., Fattahi, F. Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (207), e66133, doi:10.3791/66133 (2024).

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