Дифференцировка линий энтеральной нервной системы из плюрипотентных стволовых клеток человека

Энтеральная нервная система (ЭНС) является крупнейшим компонентом периферической нервной системы. ЭНС содержит более 400 миллионов нейронов, которые расположены в желудочно-кишечном тракте и контролируют почти все функции кишечника. Молекулярное понимание развития и функции ЭНС и ее дефектов при энтеральных невропатиях требует доступа к надежному и достоверному источнику энтеральных нейронов. Доступ к первичным тканям человека ограничен, и животные модели не могут воспроизвести ключевые фенотипы заболеваний при многих кишечных невропатиях. Технология плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC) оказалась чрезвычайно полезной в обеспечении неограниченного источника желаемых типов клеток, особенно тех, которые трудно выделить из первичных источников 2,3,4,5,6,7. Здесь мы подробно описываем поэтапный и надежный метод in vitro для получения культур ЭНС из ЧПСК. Эти масштабируемые культуры, полученные из hPSC, открывают возможности для исследований развития, моделирования заболеваний и высокопроизводительного скрининга лекарств и могут обеспечить трансплантируемые клетки для регенеративной медицины.

Линии кишечных нейронов происходят от клеток нервного гребня (НК), следующих по пути развития ЭНС во время эмбриогенеза. У эмбрионов NC-клетки появляются по краям складчатой нервной пластинки. Они размножаются, мигрируют и дают начало множеству различных типов клеток, включая сенсорные нейроны, шванновские клетки, меланоциты, черепно-лицевой скелет и энтеральные нейроны, а также глии ^8,9,10. Решение о судьбе клетки зависит от отдельной области вдоль передне-задней оси, из которой выходят НК-клетки, т.е. краниальной НК, НК блуждающего нерва, НК туловища и НК крестца. ЭНС развивается из вагусных и сакральных НК-клеток, причем первые доминируют в популяции кишечных нейронов из-за обширной миграции по длине кишечника и колонизации кишечника¹¹.

Получение НК-клеток из ПСК обычно включает комбинацию двойного ингибирования SMAD и активации пути WNT^12,13. До недавнего времени все протоколы индукции НЗ включали добавление сыворотки и других добавок продуктов животного происхождения в условия культивирования. Химически неопределенные среды не только снижают воспроизводимость индукции ЧПУ, но и затрудняют механистические исследования развития. Чтобы преодолеть эти проблемы, Barber et^{al. 14} разработали протокол индукции NC с использованием химически определенных условий культивирования и, следовательно, имел преимущество по сравнению с альтернативными методами, которые полагаются на факторы замещения сыворотки (например, KSR)^13,14. Это было получено путем замещения базальных сред и оптимизации протокола, первоначально представленного Fattahi et al. для получения кишечных НК из hPSCs. Эта усовершенствованная система является основой представленного здесь протокола дифференцировки hPSC. Он начинается с индукции клеток кишечного нервного гребня (ENC) в течение 15-дневного периода путем точной модуляции сигналов BMP, FGF, WNT и TGFβ в дополнение к ретиноевой кислоте (RA). Затем мы получаем линии ЭНС путем обработки клеток нейротрофическим фактором глиальных клеток (GDNF). Все композиции сред определяются химически и дают устойчивые культуры кишечных нейронов в течение 30-40 дней.

В дополнение к описанной здесь монослойной системе культивирования клеток были разработаны альтернативные подходы к индукции НК, в которых используются свободно плавающие эмбриоидные тельца^15,16. Было показано, что мигрирующие клетки в этих культурах экспрессируют маркеры NC с субпопуляцией, представляющей НК блуждающего нерва. Кокультуры с первичной тканью кишечника были использованы для обогащения кишечных предшественников НК в этих культурах. Медиа-композиции в этих исследованиях содержат комбинацию различных факторов, таких как фактор роста нервов, NT3 и нейротрофический фактор мозга. На данном этапе не совсем ясно, как эти факторы могут повлиять на идентичность предшественников энтеральных нейронов. Для эффективного сравнения индукции энтерального НК в монослое и культурах, основанных на эмбриоидном теле, требуется больше данных. Учитывая различия в расположении культур в этих стратегиях, использование каждого метода должно быть рассмотрено и оптимизировано в соответствии с конкретным приложением.

Представленный здесь протокол является воспроизводимым и был успешно протестирован нами и другими специалистами с использованием^{различных линий} hPSC (индуцированных и эмбриональных) ^8,14,16.