Summary

تمايز سلالات الجهاز العصبي المعوي عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Published: May 17, 2024
doi:

Summary

يوفر اشتقاق سلالات الجهاز العصبي المعوي (ENS) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) مصدرا قابلا للتطوير للخلايا لدراسة تطور ENS والمرض ، واستخدامه في الطب التجديدي. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل في المختبر لاشتقاق الخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا.

Abstract

الجهاز العصبي المعوي البشري ، ENS، هو شبكة كبيرة من أنواع الخلايا الدبقية والعصبية مع تنوع ملحوظ في الناقلات العصبية. يتحكم ENS في حركة الأمعاء وإفراز الإنزيم وامتصاص العناصر الغذائية ويتفاعل مع الجهاز المناعي وميكروبيوم الأمعاء. وبالتالي ، فإن العيوب التنموية والمكتسبة في ENS هي المسؤولة عن العديد من الأمراض البشرية وقد تسهم في أعراض مرض باركنسون. تشكل القيود في أنظمة النماذج الحيوانية والوصول إلى الأنسجة الأولية تحديات تجريبية كبيرة في دراسات ENS. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل للاشتقاق الفعال في المختبر لسلالات ENS من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، hPSC ، باستخدام ظروف ثقافة محددة. يبدأ بروتوكولنا بالتمايز الموجه ل hPSCs إلى خلايا القمة العصبية المعوية في غضون 15 يوما وينتج أنواعا فرعية متنوعة من الخلايا العصبية المعوية الوظيفية في غضون 30 يوما. توفر هذه المنصة موردا قابلا للتطوير للدراسات التنموية ونمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والتطبيقات التجديدية.

Introduction

الجهاز العصبي المعوي (ENS) هو أكبر مكون للجهاز العصبي المحيطي. يحتوي ENS على أكثر من 400 مليون خلية عصبية تقع داخل الجهاز الهضمي وتتحكم في جميع وظائف القناة الهضمية 1تقريبا. يتطلب الفهم الجزيئي لتطور ووظيفة ENS وعيوبه في اعتلالات الأعصاب المعوية الوصول إلى مصدر موثوق وأصيل للخلايا العصبية المعوية. الوصول إلى الأنسجة الأولية البشرية محدود ، وتفشل النماذج الحيوانية في تلخيص الأنماط الظاهرية الرئيسية للمرض في العديد من اعتلالات الأعصاب المعوية. أثبتت تقنية الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) أنها مفيدة للغاية في توفير مصدر غير محدود لأنواع الخلايا المرغوبة ، خاصة تلك التي يصعب عزلها عن المصادر الأولية2،3،4،5،6،7. هنا ، نقدم تفاصيل عن طريقة تدريجية وقوية في المختبر للحصول على ثقافات ENS من hPSCs. تفتح هذه الثقافات المشتقة من hPSC القابلة للتطوير سبلا للدراسات التنموية ونمذجة الأمراض وفحص الأدوية عالي الإنتاجية ويمكن أن توفر خلايا قابلة للزرع للطب التجديدي.

يتم اشتقاق سلالات الخلايا العصبية المعوية من خلايا القمة العصبية (NC) التي تتبع مسار تطور ENS أثناء التطور الجنيني. في الأجنة ، تظهر خلايا NC على طول هوامش الصفيحة العصبية القابلة للطي. تتكاثر وتهاجر وتؤدي إلى العديد من أنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية الحسية وخلايا شوان والخلايا الصباغية والهيكل العظمي القحفي الوجهي والخلايا العصبية المعوية والدبقية8،9،10. يعتمد قرار مصير الخلية على المنطقة المميزة على طول المحور الأمامي الخلفي الذي تخرج منه خلايا NC ، أي NC القحفي ، NC المبهم ، الجذع NC و NC العجزي. يتطور ENS من خلايا NC المبهمة والعجزية مع سيطرة الأولى على سكان الخلايا العصبية المعوية بسبب الهجرة الواسعة على طول الأمعاء واستعمار الأمعاء11.

عادة ما يتضمن اشتقاق خلايا NC من PSCs مزيجا من تثبيط SMAD المزدوج وتنشيط مسار WNT12,13. حتى وقت قريب ، تضمنت جميع بروتوكولات تحريض NC المصل وإضافات المنتجات الحيوانية الأخرى في ظروف الاستزراع. لا تقلل الوسائط غير المحددة كيميائيا من قابلية استنساخ تحريض NC فحسب ، بل تتحدى أيضا الدراسات التنموية الآلية. للتغلب على هذه التحديات ، طور Barber etal 14 بروتوكول تحريض NC باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا ، وبالتالي كان مفيدا على الطرق البديلة التي تعتمد على عوامل استبدال المصل (على سبيل المثال ، KSR) 13،14. تم الحصول على هذا عن طريق استبدال الوسائط القاعدية وتحسين بروتوكول قدمه في الأصل Fattahi et al لاشتقاق خلايا NC المعوية من hPSCs. هذا النظام المحسن هو أساس بروتوكول التمايز hPSC المعروض هنا. يبدأ بتحريض خلايا القمة العصبية المعوية (ENC) في فترة 15 يوما عن طريق التعديل الدقيق لإشارات BMP و FGF و WNT و TGFβ بالإضافة إلى حمض الريتينويك (RA). ثم نشتق سلالات ENS عن طريق علاج الخلايا بعامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF). يتم تعريف جميع تركيبات الوسائط كيميائيا وتنتج ثقافات عصبية معوية قوية في غضون 30-40 يوما.

بالإضافة إلى نظام زراعة الخلايا أحادية الطبقة الموصوف هنا ، تم تطوير مناهج تحريض NC بديلة تستخدم الأجسام الجنينية العائمةالحرة 15,16. وقد تبين أن الخلايا المهاجرة في هذه الثقافات تعبر عن علامات NC مع مجموعة فرعية تمثل NC المبهم. تم استخدام الثقافات المشتركة مع أنسجة الأمعاء الأولية لإثراء سلائف NC المعوية في هذه الثقافات. تحتوي تركيبات الوسائط في هذه الدراسات على مجموعة من العوامل المختلفة مثل عامل نمو الأعصاب و NT3 وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ. في هذه المرحلة ، ليس من الواضح تماما كيف يمكن أن تؤثر هذه العوامل على هويات الالتزام بسلائف الخلايا العصبية المعوية. لإجراء مقارنة فعالة لتحريض NC المعوي في الطبقة الأحادية والثقافات القائمة على الجسم الجنيني ، يلزم المزيد من البيانات. بالنظر إلى تخطيطات الثقافة المختلفة في هذه الاستراتيجيات ، يجب النظر في استخدام كل طريقة وتحسينها وفقا لتطبيق محدد في الاعتبار.

البروتوكول المقدم هنا قابل للتكرار وقد تم اختباره بنجاح من قبلنا ومن قبل الآخرين باستخدام خطوط hPSC المختلفة (المستحثة والجنينية)8،14،16.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام ملاحظة: التركيزات المذكورة في البروتوكول هي التركيزات النهائية لمكونات الوسائط. قم بإعداد جميع الوسائط في ظروف معقمة في غطاء تدفق رقائقي ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام. استخدم في غضون 2 أسابيع. وسيط صيانة hPSC: مكمل وسي?…

Representative Results

يوفر هذا البروتوكول طريقة لاشتقاق القمة العصبية المعوية والخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا (الشكل 1A-B). يعتمد توليد خلايا عصبية عالية الجودة على خطوة تحريض قمة عصبية معوية فعالة. يمكن تقييم ذلك بصريا عن طريق التحقق من مورفولوجي?…

Discussion

يوفر بروتوكول التمايز الموصوف هنا طريقة قوية في المختبر للحصول على الخلايا العصبية المعوية من hPSCs في غضون 30-40 يوما (الشكل 1E) والدبقية المعوية التي تعبر عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي ، GFAP ، و SOX10 في الثقافات القديمة (> اليوم 55)13،14،

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم العمل بمنح من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية المتقدمة ومؤسسة ساندلر ، ومنحة March of Dimes رقم 1-FY18-394 و 1DP2NS116769-01 ، وجائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية للصحة (DP2NS116769) إلى FF والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R01DK121169) إلى FF ، HM مدعوم من زمالة ما بعد الدكتوراه لمؤسسة Larry L. Hillblom ، زمالة NIH T32-DK007418 وبرنامج UCSF لزمالة ما بعد الدكتوراه المستقلة للبحوث الطبية الحيوية.

Materials

Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A) Gibco 12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex Gibco A14133-2
BMP4 R&D systems 314-BP
Cell culture centrifuge Eppendorf, model no. 5810R 02262501
Cell detachment solution, Accutase Stemcell Technologies 07920
CHIR99021 Tocris 4423
Conical tubes USA scientific 1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6 Life Technologies A1516401
DMEM/F-12 no glutamine Life Technologies 21331020
EDTA Corning MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit Life Technologies A2858501
FGF2 R&D systems 233-FB/CF
Fibronectin Corning 356008
GDNF Peprotech 450-10
Hemocytometer Hausser Scientific 1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC WiCell RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 Thermo Fisher Scientific Herralcell 150i
Inverted microscope Thermo Fisher Scientific EVOS FL
Laminar flow hood Thermo Fisher Scientific 1300 series class II, type A2
Laminin Cultrex 3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro Corning 25-015-CI
MEM NEAAs Corning 25-025-CI
Multiwell plates, Falcon BD 353934, 353075
N-2 Supplement CTS A1370701
Neurobasal Medium Life Technologies 21103049
PBS (Ca and Mg free) Life Technologies 10010023
Pipette filler Eppendorf Z768715-1EA
Pipette tips USA scientific 1111-2830
Pipettes Fisherbrand 13-678-11E, 13-678-11F
PO Sigma-Aldrich P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi ibidi 81156
RA Sigma-Aldrich R2625
SB431542 R&D systems 1614
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250-061
Ultra-low attachment plates Fisher Scientific 07-200-601
Y-27632 dihydrochloride R&D systems 1254

References

  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
  3. Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
  4. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
  5. Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  8. Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
  9. Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
  10. Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
  11. Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
  12. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
  13. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  14. Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
  15. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  16. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
  17. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
  18. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
  19. Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
  20. Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
  21. Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
  22. Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).

Play Video

Cite This Article
Majd, H., Richter, M. N., Samuel, R. M., Kalantari, A., Ramirez, J. T., Fattahi, F. Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (207), e66133, doi:10.3791/66133 (2024).

View Video