Summary

Использование анализа расщепления под мишенями и тегирования (CUT&Tag) в исследовании миобластов мышей

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Исследователи, не знакомые с эпигенетической областью, обнаружат, что CUT&Tag является значительно более простой альтернативой анализам ChIP. Система CUT&Tag оказала огромную пользу эпигенетическим исследованиям редких и первичных клеточных популяций, получив высококачественные данные из очень небольшого числа клеток. Этот протокол описывает проведение анализов H3K4me1 CUT&Tag на мышиных миобластах, выделенных из мышц задних конечностей мыши.

Abstract

Этот документ по протоколу направлен на то, чтобы предоставить новым исследователям полную информацию об использовании технологии Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) для профилирования геномных мест связывающих хроматин-связывающих факторов, меток гистонов и вариантов гистонов. Протоколы CUT&Tag очень хорошо работают с мышиными миобластами и свежевыделенными мышечными стволовыми клетками (MuSC). Они могут быть легко применены ко многим другим типам клеток, при условии, что клетки могут быть иммобилизованы шариками Конканавалина-А. По сравнению с CUT&Tag, иммунопреципитация хроматина (ChIP) является трудоемким экспериментом. Анализы ChIP требуют предварительной обработки хроматина перед тем, как хроматический материал можно будет использовать для иммунопреципитации. При сшивании ChIP (X-ChIP) предварительная обработка хроматина включает в себя сшивку и ультразвук для фрагментации хроматина. В случае нативного ChIP (N-ChIP) фрагментированные хроматины обычно достигаются путем расщепления микрококковой нуклеазы (MNase). Как ультразвуковая терапия, так и переваривание MNазы вносят некоторую предвзятость в эксперименты с ChIP. Анализы CUT&Tag могут быть завершены за меньшее количество этапов и требуют гораздо меньшего количества клеток по сравнению с ChIP, но обеспечивают более объективную информацию о факторах транскрипции или метках гистонов в различных геномных местах. CUT&Tag может работать всего с 5 000 ячеек. Благодаря более высокой чувствительности и более низкому фоновому сигналу по сравнению с ChIP, исследователи могут рассчитывать на получение надежных пиковых данных всего за несколько миллионов прочтений после секвенирования.

Introduction

Тест CUT&Tag был изобретен для компенсации некоторых явных недостатков ChIPs1. Двумя основными недостатками ChIPs являются: 1) смещение, возникающее при фрагментации хроматина, и 2) неспособность работать с малым числом клеток. Анализы X-ChIP основаны либо на ультразвуковом расщеплении, либо на расщеплении MNазы для получения фрагментов хроматина, в то время как N-ChIP в основном использует расщепление MNазы для получения нуклеосом. Ультразвуковая обработка показывает смещение в сторону ослабленных мест расположения хроматина, таких как промоторные области2, и, по-видимому, переваривание МНазы также более эффективно работает на расслабленных волокнах хроматина. Более того, некоторые сообщили, что расщепление MNазы также показывает смещение, зависящее от последовательности ДНК3. Таким образом, на этапе подготовки входных данных анализов ChIP невозможно получить фрагменты хроматина из всех видов геномных участков совершенно случайным образом. Кроме того, анализы ChIP обычно генерируют более высокие фоновые сигналы по сравнению с CUT&Tag и требуют более чем в 10 раз больше прочтений, чем CUT&Tag, чтобы подчеркнуть, где находятся пики 1,4,5. Это объясняет, почему эксперименты с ChIP должны начинаться с гораздо большим количеством клеток, чем в CUT&Tag. Это не является проблемой при изучении клеточных линий, поскольку они могут многократно проходить для достижения очень высокого числа клеток. Тем не менее, анализ ChIP определенно не является сильным эпигенетическим инструментом для изучения редких или ценных популяций первичных клеток, хотя первичные клетки, очевидно, имеют более практическое и медицинское значение.

В то время как длительная и сложная процедура ChIP отпугивает некоторых исследователей от изучения или использования этого метода, люди более комфортно чувствуют себя с более простыми анализами, такими как иммуноцитохимия (ICC) или иммунофлуоресценция (IF). Анализ CUT&Tag по сути напоминает процесс экспериментов ICC и IF, но проводится только в пробирке. CUT&Tag не нуждается в фрагментированном хроматине, а вместо этого геном должен быть интактным для связывания антител1. В первый день эксперимента ChIP исследователи обычно тратят до 4 часов на подготовку фрагментированных хроматинов из ядер с помощью ультразвука или МНазы, прежде чем короткие кусочки хроматина могут быть смешаны с антителами-гранулами 4,5. В отличие от этого, рабочая нагрузка первого дня процедуры CUT&Tag заключается в том, чтобы просто обездвижить клетки до гранул Конканавалина-А, а затем добавить первичное антитело к клеточным гранулам. Для этого требуется всего ~40 мин1.

Стоит отметить, что расщепление под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы (CUT&RUN) является важной альтернативой CUT&TAG. CUT&RUN был создан на основе того же рабочего механизма, что и CUT&TAG. В CUT&TAG антитела направляют транспоназу pA/G-Tn5 во все места, где каждый фермент вырезает кусок хроматина и тем временем помечает его адаптерами для создания библиотек, в то время как в CUT&RUN роль pA/G-Tn5 играет pA/G-MNase, которая выполняет только режущую часть работы6. Таким образом, по сравнению с CUT&Tag, CUT&RUN требует дополнительного этапа, который заключается в приклеивании адаптеров, создающих библиотеку, к фрагментированным фрагментам ДНК pA/G-MNase 7,8. Благодаря большому сходству между CUT&Tag и CUT&RUN, исследователи, знакомые с CUT&TAG, легко адаптируются к профессиональному выполнению CUT&RUN. Тем не менее, следует отметить, что между CUT&Tag и CUT&RUN существуют некоторые незначительные различия. В протоколах CUT&RUN обычно используется физическая концентрация соли (~150 мМ) на этапах промывки, в то время как в CUT&TAG буфер для промывки 300-Dig имеет высокое содержание соли. Таким образом, CUT&Tag хорошо контролирует фон при профилировании гистоновых меток/вариантов или факторов транскрипции, поскольку эти белки напрямую и прочно связываются с ДНК1. CUT&Tag может столкнуться с проблемами при профилировании хроматин-ассоциированных факторов, которые не связываются напрямую с ДНК и демонстрируют слабое сродство к хроматину. Этапы промывки с высоким содержанием соли в CUT&Tag могут удалять факторы, связанные с хроматином, и не вызывать никаких сигналов на выходе. Несмотря на то, что существуют успешные случаи, когда CUT&Tag может быть использован для профилирования некоторых белков, не содержащих гистон и нетранскрипционный фактор9, мы все же рекомендуем использовать CUT&RUN вместо CUT&Tag для профилирования слабо связанных хроматин-ассоциированных белков.

После того, как млекопитающие достигают взрослого возраста, их скелетные мышечные ткани все еще содержат мышечные стволовые клетки. Во время мышечной травмы эти стволовые клетки могут быть активированы и подвергнуться увеличению и дифференцировке клеток длярегенерации поврежденных мышечных волокон. Эти стволовые клетки известны как мышечные стволовые/сателлитные клетки (MuSCs). После того, как MuSC выделены у животных или активированы при мышечной травме, они начинают пролиферировать и становятся миобластами.

Для получения MuSC из переваривания скелетных мышц мышей поверхностные маркеры MuSC, такие как Vcam1 (Cd106), Cd34 и α7-интегрин (Itga7), часто используются по отдельности или в комбинациях для обогащения MuSC во время флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS)11. Было показано, что Cd31/Cd45/Sca1/Vcam1+ является, вероятно, лучшей комбинацией маркеров для получения >95% чистых MuSCs12. FACS может выделять чистые MuSC сразу после переваривания свежих мышц. Однако, если в экспериментальном дизайне не требуются чистые MuSC непосредственно при их выделении, предварительное покрытие является более экономически эффективным, чем FACS, для получения >90% чистых миобластов (потомство MuSC).

MuSC, только что выделенные от мышей, не пролиферируют эффективно в среде F10 Хама, дополненной фетальной бычьей сывороткой (FBS). Чтобы лучше увеличить количество клеток MuSCs и получить достаточное количество миобластов, вместо FBS следует использовать сыворотку роста крупного рогатого скота (BGS). Однако, если BGS недоступна, полную среду F10 Ham (содержащую около 20% FBS) можно смешивать с равным объемом Т-клеточной условной среды для значительного увеличения миобласта13. Таким образом, в данном протоколе будет также описано получение Т-клеточных сред, кондиционированных MuSC.

Самое главное, что этот протокол представляет собой полный пример проведения анализов H3K4me1 CUT&Tag на мышиных миобластах, выделенных из мышц задних конечностей мыши. Обратите внимание, что этот протокол также применяется к другим типам клеток, гистоновым меткам и вариантам гистонов, и читателям необходимо оптимизировать только количество клеток или антител для своих случаев на основе обогащения конкретных гистоновых меток или вариантов, которые они изучают.

Для использования в CUT&Tag или CUT&RUN Tn5 или MNaза должна быть слита с белком A или белком G для получения pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase или pG-MNase. По-видимому, и белок А, и белок G могут быть слиты с этими ферментами одновременно для получения pA/G-Tn5 или pA/G-MNase. Белок А и белок G демонстрируют дифференциальное сродство к IgG разных видов. Таким образом, слияние белка А и белка G с ферментом может решить эту проблему и сделать фермент совместимым с антителами нескольких видов.

Protocol

Все методы, представленные в этой рукописи, одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию лаборатории в Гуанчжоу. Мыши, использованные для получения репрезентативных результатов этой рукописи, содержались и содержались в соответствии с руководящими ?…

Representative Results

Прежде чем связывать клетки с шариками Конканавалина-А, проверьте клеточную суспензию под микроскопом. Соответственно, после инкубации клеток с шариками Конканавалина-А пробирки с образцами помещают на магнитный штатив, а надосадочную жидкость следует снова наблюдать с помощью микро…

Discussion

Конкретное количество клеток, необходимое для определенной реакции CUT&Tag, полностью зависит от обогащения гистоновыми метками/вариантами или хроматин-связывающими белками, которые должны быть исследованы. Обычно для сильно обогащенных гистоновых меток, таких как H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac и т.д., 25…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Программой стратегических приоритетных исследований Китайской академии наук (XDA16020400-PH); Национальный фонд естественных наук Китая (32170804-PH).

Materials

bFGF R&D Systems 233-FB-025
Collagen Corning 354236
Collagenase II Worthington LS004177
Concanavalin-A Sigma-Aldrich C5275
Concanavalin-A beads Bangs Laboratories BP531
Digitonin Sigma-Aldrich 300410
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
H3K4me1 antibody  abcam ab8895
Ham's F10 media Thermo Fisher Scientific 11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina  Vazyme TD903 This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes Qualityard QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes Anosun Magnetic CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix NEB M0541L For library-making PCR reaction
pA-Tn5 Vazyme S603-01 Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 5056489001
Proteinase K Beyotime ST535-100mg
RPMI-1640 media Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) Antibodies-online ABIN101961
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina  Vazyme TD202 This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers 
VAHTS DNA Clean Beads  Vazyme N411 Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size

References

  1. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).
  2. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLife. 4, e09225 (2015).
  3. Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
  4. Policastro, R. A., Zentner, G. E. Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites. Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).
  5. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  6. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, e21856 (2017).
  7. Mezger, A., et al. High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution. Nat Commun. 9, 3647 (2018).
  8. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8, 14049 (2017).
  9. Nakka, K., et al. JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment. Science. 377 (6606), 666-669 (2022).
  10. Fu, X., Wang, H., Hu, P. Stem cell activation in skeletal muscle regeneration. Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).
  11. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skelet Muscle. 6, 35 (2016).
  12. Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).
  13. Fu, X., et al. Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion. Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).
  14. Li, Y., et al. Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag. STAR Protoc. 2 (3), 100751 (2021).
  15. Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).
  16. Wardle, F. C. Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod. J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).
  17. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  18. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  19. Faralli, H., et al. UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration. J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).
  20. Yang, J. H., et al. Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).
  21. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).

Play Video

Cite This Article
Li, Y., Wu, X., Hu, P. Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) Assay in Mouse Myoblast Research. J. Vis. Exp. (205), e66066, doi:10.3791/66066 (2024).

View Video