Summary

Utilisation du clivage sous cibles et du test de marquage (CUT & Tag) dans la recherche sur le myoblaste chez la souris

Published: March 01, 2024
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Summary

Les chercheurs novices dans le domaine de l’épigénétique trouveront que CUT&Tag est une alternative beaucoup plus facile aux tests ChIP. CUT&Tag a énormément bénéficié aux études épigénétiques sur des populations de cellules rares et primaires, générant des données de haute qualité à partir de très peu de cellules. Ce protocole décrit la réalisation de dosages H3K4me1 CUT&Tag sur des myoblastes de souris isolés des muscles des membres postérieurs de souris.

Abstract

Ce document de protocole vise à fournir aux nouveaux chercheurs tous les détails de l’utilisation de Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT & Tagmentation) pour profiler les emplacements génomiques des facteurs de liaison à la chromatine, des marques d’histones et des variantes d’histones. Les protocoles CUT&Tag fonctionnent très bien avec les myoblastes de souris et les cellules souches musculaires fraîchement isolées (MuSCs). Ils peuvent facilement être appliqués à de nombreux autres types de cellules tant que les cellules peuvent être immobilisées par des billes de Concanavalin-A. Par rapport à CUT&Tag, les tests d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) sont des expériences qui prennent beaucoup de temps. Les dosages ChIP nécessitent un prétraitement de la chromatine avant que le matériau chromatique puisse être utilisé pour l’immunoprécipitation. Dans la ChIP réticulée (X-ChIP), le prétraitement de la chromatine implique la réticulation et la sonication pour fragmenter la chromatine. Dans le cas de la ChIP native (N-ChIP), les chromatines fragmentées sont normalement obtenues par la digestion des nucléases micrococciques (MNase). La sonication et la digestion MNase introduisent toutes deux un certain biais dans les expériences ChIP. Les tests CUT&Tag peuvent être réalisés en moins d’étapes et nécessitent beaucoup moins de cellules que les ChIP, mais fournissent des informations plus impartiales sur les facteurs de transcription ou les marques d’histones à divers endroits génomiques. CUT&Tag peut fonctionner avec seulement 5 000 cellules. En raison de sa sensibilité plus élevée et de son signal de fond plus faible que les ChIP, les chercheurs peuvent s’attendre à obtenir des données de pointe fiables à partir de seulement quelques millions de lectures après le séquençage.

Introduction

Le test CUT&Tag a été inventé pour compenser certains défauts manifestes des ChIPs1. Les deux principaux inconvénients des ChIPs sont 1) le biais introduit lors de la fragmentation de la chromatine et 2) l’incompétence à travailler avec un faible nombre de cellules. Les dosages X-ChIP reposent sur la sonication ou la digestion MNase pour obtenir des fragments de chromatine, tandis que la N-ChIP utilise principalement la digestion MNase pour obtenir des nucléosomes. La sonication montre un biais vers les emplacements de la chromatine détendus tels que les régions promotrinales2, et apparemment, la digestion de la MNase fonctionne également plus efficacement sur les fibres de chromatine détendues. De plus, certains ont rapporté que la digestion de la MNase présente également un biais dépendant de la séquence d’ADN3. Par conséquent, à l’étape de préparation des tests ChIP, il est impossible d’obtenir des fragments de chromatine de toutes sortes d’emplacements génomiques de manière parfaitement aléatoire. De plus, les tests ChIP génèrent normalement des signaux de fond plus élevés que CUT&Tag et nécessitent plus de 10 fois plus de lectures que CUT&Tag pour accentuer là où les pics sontde 1,4,5. C’est pourquoi les expériences ChIP doivent commencer avec beaucoup plus de cellules que CUT&Tag. Ce n’est pas un problème lors de l’étude des lignées cellulaires car elles peuvent être passées de manière répétitive pour obtenir un nombre de cellules très élevé. Cependant, le test ChIP n’est certainement pas un outil épigénétique puissant pour étudier des populations de cellules primaires rares ou précieuses, bien que les cellules primaires aient évidemment des implications plus pratiques et médicales.

Bien que la procédure longue et compliquée de la ChIP décourage certains chercheurs d’apprendre ou d’utiliser cette technique, les gens sont plus à l’aise avec des tests plus faciles tels que l’immunocytochimie (ICC) ou l’immunofluorescence (IF). Un test CUT&Tag ressemble essentiellement au processus des expériences ICC et IF, mais n’a lieu que dans un tube à essai. CUT&Tag n’a pas besoin de chromatine fragmentée pour commencer, mais le génome doit être intact pour la liaison de l’anticorps1. Le premier jour d’une expérience ChIP, les chercheurs passent normalement jusqu’à 4 heures à préparer les chromatines fragmentées des noyaux par sonication ou digestion MNase avant que les courts morceaux de chromatine puissent être mélangés avec des billes d’anticorps 4,5. À l’opposé, la charge de travail du premier jour d’une procédure CUT&Tag consiste simplement à immobiliser les cellules dans des billes de Concanavalin-A, puis à ajouter l’anticorps primaire sur les billes cellulaires. Cela ne nécessite que ~40 min1.

Il convient de mentionner que le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de nucléases (CUT & RUN) est une alternative importante à CUT&Tag. CUT&RUN a été créé sur la base d’un mécanisme de fonctionnement similaire à celui de CUT&Tag. Dans CUT&Tag, les anticorps guident la transposase pA/G-Tn5 vers tous les endroits où l’enzyme va chacun découper un morceau de chromatine et le marquer pendant ce temps avec des adaptateurs créant une bibliothèque, tandis que dans CUT&RUN, le rôle de pA/G-Tn5 est joué par la pA/G-MNase qui n’effectue que la partie coupante du travail6. Par conséquent, par rapport à CUT&Tag, CUT&RUN nécessite une étape supplémentaire qui consiste à coller les adaptateurs de création de bibliothèque sur les morceaux d’ADN fragmentés pA/G-MNase 7,8. En raison des grandes similitudes entre CUT&Tag et CUT&RUN, les chercheurs familiers avec CUT&TAG s’adapteront facilement à la réalisation compétente de CUT&RUN. Cependant, il convient de noter qu’il existe quelques différences mineures entre CUT&Tag et CUT&RUN. Les protocoles CUT&RUN utilisent normalement la concentration physique de sel (~150 mM) dans les étapes de lavage, tandis que dans CUT&Tag, le tampon de lavage 300-Dig est riche en sel. Par conséquent, CUT&Tag est efficace pour contrôler le bruit de fond lors du profilage des marques/variantes d’histones ou des facteurs de transcription, car ces protéines se lient directement et fortement à l’ADN1. CUT&Tag peut rencontrer des problèmes lors du profilage des facteurs associés à la chromatine qui ne se lient pas directement à l’ADN et montrent une faible affinité avec la chromatine. Les étapes élevées de lavage au sel dans CUT&Tag peuvent éliminer les facteurs associés à la chromatine et ne provoquer aucun signal dans la sortie finale. Bien qu’il existe des cas réussis où CUT&Tag peut être utilisé pour profiler certaines protéines non histones/non-facteurs de transcription9, nous recommandons toujours CUT&RUN plutôt que CUT&Tag pour profiler les protéines associées à la chromatine faiblement liées.

Une fois que les mammifères ont atteint l’âge adulte, leurs tissus musculaires squelettiques contiennent encore des cellules souches musculaires. Lors d’une lésion musculaire, ces cellules souches peuvent être activées et subir une expansion et une différenciation du nombre de cellules pour régénérer les fibres musculaires endommagées10. Ces cellules souches sont connues sous le nom de cellules souches/satellites musculaires (MuSC). Une fois que les MuSC sont isolés chez les animaux ou une fois activés par une blessure musculaire, ils commencent à proliférer et deviennent des myoblastes.

Pour obtenir des MuSC à partir de la digestion des muscles squelettiques de souris, les marqueurs de surface MuSC tels que Vcam1 (Cd106), Cd34 et l’intégrine α7 (Itga7) sont souvent utilisés individuellement ou en combinaison pour enrichir les MuSC lors du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)11. Il a été démontré que Cd31/Cd45/Sca1-/Vcam1+ est probablement la meilleure combinaison de marqueurs pour obtenir des MuSCs12 purs à >95%. Le FACS peut isoler les MuSC purs juste après la digestion des muscles frais. Cependant, si la conception expérimentale ne nécessite pas de MuSC purs dès leur isolement, le pré-placage est plus rentable que le FACS pour obtenir des myoblastes purs à >90% (descendance MuSC).

Les MuSC fraîchement isolés chez la souris ne prolifèrent pas efficacement dans les milieux F10 de Ham complétés par du sérum fœtal bovin (FBS). Pour mieux augmenter le nombre de cellules de MuSC et obtenir suffisamment de myoblastes, le sérum de croissance bovine (BGS) doit être utilisé à la place du FBS. Cependant, si le BGS n’est pas disponible, le milieu complet F10 de Ham (contenant environ 20 % de FBS) peut être mélangé avec un volume égal de milieu conditionnel à cellules T pour favoriser considérablement l’expansion des myoblastes13. Par conséquent, ce protocole décrira également la préparation de milieux MuSC conditionnés par des cellules T.

Plus important encore, ce protocole fournit un exemple complet de réalisation de tests H3K4me1 CUT&Tag sur des myoblastes de souris isolés des muscles des membres postérieurs de souris. Veuillez noter que ce protocole s’applique également à d’autres types de cellules et aux marques d’histones et aux variantes d’histones, et que les lecteurs n’ont qu’à optimiser le nombre de cellules ou les quantités d’anticorps pour leurs cas en fonction de l’enrichissement des marques ou variantes d’histones spécifiques qu’ils étudient.

Pour être utilisée dans CUT&Tag ou CUT&RUN, la Tn5 ou la MNase doit être fusionnée avec la protéine A ou la protéine G pour former pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase ou pG-MNase. Apparemment, les protéines A et G peuvent être fusionnées sur ces enzymes en même temps pour générer pA/G-Tn5 ou pA/G-MNase. Les protéines A et G présentent des affinités différentielles pour les IgG de différentes espèces. Par conséquent, la fusion des protéines A et G sur l’enzyme peut surmonter ce problème et rendre l’enzyme compatible avec les anticorps de plusieurs espèces.

Protocol

Les méthodes présentées dans ce manuscrit sont toutes approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du laboratoire de Guangzhou. Les souris utilisées pour générer les résultats représentatifs de ce manuscrit ont été hébergées et entretenues conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du laboratoire de Guangzhou. 1. Isolement du myoblaste des muscles des membres postérieurs de la souris (exem…

Representative Results

Avant de lier des cellules à des billes de Concanavalin-A, vérifiez la suspension cellulaire au microscope. Par conséquent, après avoir incubé les cellules avec des billes de Concanavalin-A, placez les tubes d’échantillon sur le support magnétique, et le surnageant devrait être observé à nouveau à l’aide d’un microscope. Il s’agit d’évaluer l’efficacité avec laquelle les cellules ont été capturées par les billes de Concanavalin-A. Le tampon de lavage contenant 7 x 105 cellules/mL do…

Discussion

Le nombre spécifique de cellules requis dans une certaine réaction CUT&Tag dépend entièrement de l’enrichissement des marques/variantes d’histones ou des protéines de liaison à la chromatine qui doivent être testées. Normalement, pour des marques d’histones très enrichies telles que H3K4me1, H3K4me3 et H3K27ac, etc., 25 000 à 50 000 myoblastes sont tout à fait suffisants pour une réaction CUT&Tag. Cependant, certaines protéines rares de liaison à la chromatine peuvent nécessiter jusqu’à 250 000 ce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par le Programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des sciences (XDA16020400 à PH) ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32170804 à PH).

Materials

bFGF R&D Systems 233-FB-025
Collagen Corning 354236
Collagenase II Worthington LS004177
Concanavalin-A Sigma-Aldrich C5275
Concanavalin-A beads Bangs Laboratories BP531
Digitonin Sigma-Aldrich 300410
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
H3K4me1 antibody  abcam ab8895
Ham's F10 media Thermo Fisher Scientific 11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina  Vazyme TD903 This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes Qualityard QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes Anosun Magnetic CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix NEB M0541L For library-making PCR reaction
pA-Tn5 Vazyme S603-01 Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 5056489001
Proteinase K Beyotime ST535-100mg
RPMI-1640 media Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) Antibodies-online ABIN101961
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina  Vazyme TD202 This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers 
VAHTS DNA Clean Beads  Vazyme N411 Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size

References

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Cite This Article
Li, Y., Wu, X., Hu, P. Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) Assay in Mouse Myoblast Research. J. Vis. Exp. (205), e66066, doi:10.3791/66066 (2024).

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