Summary

Uma abordagem abrangente para analisar os componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Este estudo descreve um método rápido e eficaz para a análise de componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais através da dissolução de coágulos, coloração celular e exame de sangue de rotina.

Abstract

A trombose cerebral, um coágulo sanguíneo em uma artéria ou veia cerebral, é o tipo mais comum de infarto cerebral. O estudo dos componentes celulares dos coágulos sanguíneos cerebrais é importante para o diagnóstico, tratamento e prognóstico. No entanto, as abordagens atuais para estudar os componentes celulares dos coágulos são baseadas principalmente na coloração in situ , o que é inadequado para o estudo abrangente dos componentes celulares porque as células estão firmemente envolvidas nos coágulos. Estudos anteriores conseguiram isolar uma enzima fibrinolítica (FEs) de Sipunculus nudus, que pode degradar diretamente a fibrina reticulada, liberando os componentes celulares. Este estudo estabeleceu um método abrangente baseado na FEF para estudar os componentes celulares do trombo cerebral. Esse protocolo inclui dissolução de coágulos, liberação de células, coloração de células e exame de sangue de rotina. De acordo com esse método, os componentes celulares puderam ser estudados quantitativa e qualitativamente. Os resultados representativos dos experimentos que utilizam este método são mostrados.

Introduction

A doença cerebrovascular é uma das três principais doenças que podem ameaçar a saúde humana, dentre as quais a doença cerebrovascular isquêmica é responsável por mais de 80%. A trombose cerebral e a trombose venosa cerebral são as doenças isquêmicas cerebrovasculares mais afetadas na atualidade, causadas principalmente por coágulos sanguíneoscerebrais1,2. Se o tratamento não for feito adequadamente, terá altas taxas de incapacidade e mortalidade e alta taxa de recorrência após a altahospitalar3.

Recentemente, um número crescente de estudos tem demonstrado que os componentes celulares dos coágulos sanguíneos cerebrais estão estreitamente correlacionados com o diagnóstico, tratamento e prognóstico da trombosecerebral4,5,6. Portanto, a disponibilidade de dados sobre a composição do trombo, especialmente os componentes celulares, é importante para o diagnóstico clínico e tratamento. Infelizmente, os métodos atualmente disponíveis não podem analisar quantitativa e qualitativamente o componente do coágulo sanguíneo. Por exemplo, a coloração in situ baseada em Martius Scarlett Blue só pode estudar os glóbulos vermelhos/brancos de certas fatias do coágulo7. A coloração in situ baseada em imuno-histoquímica (IHQ) só pode estudar componentes sanguíneos limitados de certos cortes do coágulo usando seus anticorpos8. Os métodos microscópicos baseados em imagens preocupam-se apenas com a estrutura específica do coágulo9. Além disso, todos esses métodos são trabalhosos e demorados10. Até o momento, os procedimentos para estudo quantitativo e qualitativo dos componentes das células dos trombos cerebrais não foram relatados. É amplamente reconhecido que a fibrina reticulada envolve firmemente as células sanguíneas nos coágulos11. Consequentemente, a degradação específica da fibrina reticulada e a liberação das células intactas são críticas para a análise precisa dos componentes celulares.

Trabalhos anteriores isolaram uma enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE), que pode degradar a fibrina específica e rapidamente12. Neste trabalho, foi proposto um método para analisar os componentes celulares dos trombos cerebrais baseado na atividade única da FEs. Esse protocolo utilizou o FE para degradar primeiramente a fibrina dos coágulos e, em seguida, analisou os componentes celulares pela coloração de Wright e exame de sangue de rotina13,14. De acordo com esse método, os componentes celulares dos trombos cerebrais podem ser estudados quantitativa e qualitativamente. Este protocolo simples e eficaz pode ser aplicado para a análise de componentes celulares de outros coágulos sanguíneos.

Protocol

A pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais do Comitê de Ética Médica da Universidade de Huaqiao. Os coágulos sanguíneos cerebrais foram removidos cirurgicamente e coletados no Quanzhou First Hospital, afiliado à Fujian Medical University, com consentimento informado dos pacientes. 1. Pré-tratamento do coágulo sanguíneo Coloque os coágulos em um prato limpo, adicione 5 mL de soro fisiológico com um tweezer, agite o prato suavemente …

Representative Results

Na fase inicial do processo de degradação, verificou-se que os coágulos sanguíneos tinham uma estrutura compacta vermelha, e a solução de trabalho era incolor. Após a incubação por 30 min, a solução de trabalho ficou vermelha clara, o que indicou que as células sanguíneas cruzadas foram liberadas na solução de trabalho. A maioria dos coágulos foi dissolvida ao prolongar o tempo de incubação para 5 h, e a solução de trabalho tornou-se vermelha clara. Ao contrário, não houve alteração significativa …

Discussion

O FEs é um agente fibrinolítico capaz de degradar a fibrina de forma direta e eficaz12,16. Aqui, o sFE foi empregado para degradar a fibrina reticulada dos coágulos sanguíneos cerebrais, liberar as células fechadas dentro dos coágulos e analisar qualitativa e quantitativamente os componentes celulares dos coágulos. Os dados de microscopia e o exame de sangue de rotina indicaram que as células fechadas foram liberadas dos coágulos sanguíneos. Além disso…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiada pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Cidade de Xiamen (3502Z20227197) e pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).

Materials

Agglutination Reaction Plate ROTEST RTB-4003
Auto Hematology Analyzer SYSMEX XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer  SANYO MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL) Biosharp BS-15-M
Clean bench AIRTECH BLB-1600
Constant Temperature Incubator JINGHONG JHS-400
Culture Dish (100 mm) NEST 704001
DHG Series Heating and Drying Oven  SENXIN DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance DENVER TP-213
Filter Membrane (0.22 µm) Millex GP SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge  Cence H1650-W
Microscope Slides CITOGLAS 01-30253-50
Milli-Q Reference Millipore Z00QSV0CN
Normal Saline CISEN H37022337
Optical Microscope Nikon ECLIPSE E100
Parafilm Bemis PM-996
Phosphate-Buffered Saline Beyotime C0221A
Pipette Tip (1 mL ) Axygene T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL) Axygene T-200XT-C
Pipettor (1 mL) Thermo Fisher Scientific ZY18723
Pipettor (200 µL) Thermo Fisher Scientific ZY20280
Scalpel MARTOR 23111
Small-sized Vortex Oscillator Kylin-Bell VORTEX KB3
Tweezer Hystic HKQS-180
Wright Staining Solution Beyotime C0135-500ml

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Cite This Article
Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots. J. Vis. Exp. (197), e65791, doi:10.3791/65791 (2023).

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