Summary

Un enfoque integral para analizar los componentes celulares de los coágulos sanguíneos cerebrales

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Este estudio describe un método rápido y eficaz para el análisis de componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrales a través de la disolución de coágulos, la tinción celular y el examen de sangre de rutina.

Abstract

La trombosis cerebral, un coágulo de sangre en una arteria o vena cerebral, es el tipo más común de infarto cerebral. El estudio de los componentes celulares de los coágulos sanguíneos cerebrales es importante para el diagnóstico, el tratamiento y el pronóstico. Sin embargo, los enfoques actuales para estudiar los componentes celulares de los coágulos se basan principalmente en la tinción in situ , que no es adecuada para el estudio exhaustivo de los componentes celulares porque las células están firmemente envueltas en los coágulos. Estudios anteriores han aislado con éxito una enzima fibrinolítica (sFE) de Sipunculus nudus, que puede degradar la fibrina reticulada directamente, liberando los componentes celulares. Este estudio estableció un método integral basado en el sFE para estudiar los componentes celulares del trombo cerebral. Este protocolo incluye la disolución de coágulos, la liberación de células, la tinción de células y el examen de sangre de rutina. De acuerdo con este método, los componentes celulares podrían estudiarse cuantitativa y cualitativamente. Se muestran los resultados representativos de los experimentos realizados con este método.

Introduction

La enfermedad cerebrovascular es una de las tres principales enfermedades que pueden amenazar la salud humana, entre las cuales la enfermedad cerebrovascular isquémica representa más del 80%. La trombosis cerebral y la trombosis venosa cerebral son las enfermedades cerebrovasculares isquémicas más preocupantes en la actualidad, causadas principalmente por coágulos sanguíneos cerebrales 1,2. Si el tratamiento no se realiza adecuadamente, tendrá altas tasas de discapacidad y mortalidad y una alta tasa de recurrencia después del alta3.

Recientemente, un número creciente de estudios ha demostrado que los componentes celulares de los coágulos sanguíneos cerebrales están estrechamente correlacionados con el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la trombosis cerebral 4,5,6. Por lo tanto, la disponibilidad de datos sobre la composición de los trombos, especialmente los componentes celulares, es importante para el diagnóstico clínico y el tratamiento. Desafortunadamente, los métodos disponibles actualmente no pueden analizar exhaustivamente el componente del coágulo de sangre cuantitativa y cualitativamente. Por ejemplo, la tinción in situ basada en Martius Scarlett Blue solo puede estudiar los glóbulos rojos/blancos de ciertas rebanadas del coágulo7. La tinción in situ basada en la inmunohistoquímica (IHQ) solo puede estudiar componentes sanguíneos limitados de ciertos cortes del coágulo utilizando sus anticuerpos8. Los métodos basados en imágenes microscópicas solo se ocupan de la estructura específica del coágulo9. Además, todos estos métodos son laboriosos y requieren mucho tiempo10. Hasta la fecha, no se han descrito los procedimientos para estudiar cuantitativa y cualitativamente los componentes de las células trombos cerebrales. Es ampliamente reconocido que la fibrina reticulada envuelve firmemente las células sanguíneas en los coágulos11. En consecuencia, la degradación específica de la fibrina reticulada y la liberación de las células intactas es fundamental para el análisis preciso de los componentes celulares.

Trabajos previos aislaron una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE), que puede degradar la fibrina de manera específica y rápida12. En este trabajo, se propuso un método para analizar los componentes celulares de los trombos cerebrales basado en la actividad única de sFE. Este protocolo utilizó sFE para degradar primero la fibrina de los coágulos y luego analizó los componentes celulares mediante tinción de Wright y análisis de sangre de rutina13,14. De acuerdo con este método, los componentes celulares de los trombos cerebrales pueden ser estudiados cuantitativa y cualitativamente. Este protocolo simple y efectivo podría aplicarse para el análisis de componentes celulares de otros coágulos sanguíneos.

Protocol

La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales del Comité de Ética Médica de la Universidad de Huaqiao. Los coágulos sanguíneos cerebrales se extirparon quirúrgicamente y se recogieron en el Primer Hospital de Quanzhou, afiliado a la Universidad Médica de Fujian, con el consentimiento informado de los pacientes. 1. Pretratamiento de coágulos de sangre Coloque los coágulos en un plato limpio, agregue 5 ml de solución salina fisi…

Representative Results

En la etapa inicial del proceso de degradación, se encontró que los coágulos de sangre tenían una estructura compacta roja y la solución de trabajo era incolora. Después de la incubación durante 30 minutos, la solución de trabajo se volvió de color rojo claro, lo que indicaba que las células sanguíneas cruzadas se liberaron en la solución de trabajo. La mayoría de los coágulos se disolvieron al alargar el tiempo de incubación a 5 h, y la solución de trabajo se volvió de color rojo claro. Por el contrario…

Discussion

El sFE es un agente fibrinolítico que puede degradar la fibrina de forma directa y eficaz12,16. Aquí, el sFE se empleó para degradar la fibrina reticulada de los coágulos sanguíneos cerebrales, liberar las células encerradas dentro de los coágulos y analizar los componentes celulares de los coágulos cualitativa y cuantitativamente. Los datos de la microscopía y el examen de sangre de rutina indicaron que las células encerradas se liberaron de los coágu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue financiada por la Oficina de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Xiamen (3502Z20227197) y la Oficina de Ciencia y Tecnología de la provincia de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).

Materials

Agglutination Reaction Plate ROTEST RTB-4003
Auto Hematology Analyzer SYSMEX XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer  SANYO MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL) Biosharp BS-15-M
Clean bench AIRTECH BLB-1600
Constant Temperature Incubator JINGHONG JHS-400
Culture Dish (100 mm) NEST 704001
DHG Series Heating and Drying Oven  SENXIN DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance DENVER TP-213
Filter Membrane (0.22 µm) Millex GP SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge  Cence H1650-W
Microscope Slides CITOGLAS 01-30253-50
Milli-Q Reference Millipore Z00QSV0CN
Normal Saline CISEN H37022337
Optical Microscope Nikon ECLIPSE E100
Parafilm Bemis PM-996
Phosphate-Buffered Saline Beyotime C0221A
Pipette Tip (1 mL ) Axygene T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL) Axygene T-200XT-C
Pipettor (1 mL) Thermo Fisher Scientific ZY18723
Pipettor (200 µL) Thermo Fisher Scientific ZY20280
Scalpel MARTOR 23111
Small-sized Vortex Oscillator Kylin-Bell VORTEX KB3
Tweezer Hystic HKQS-180
Wright Staining Solution Beyotime C0135-500ml

References

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Cite This Article
Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots. J. Vis. Exp. (197), e65791, doi:10.3791/65791 (2023).

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