Uma abordagem abrangente para analisar os componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais
Summary
Este estudo descreve um método rápido e eficaz para a análise de componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais através da dissolução de coágulos, coloração celular e exame de sangue de rotina.
Abstract
A trombose cerebral, um coágulo sanguíneo em uma artéria ou veia cerebral, é o tipo mais comum de infarto cerebral. O estudo dos componentes celulares dos coágulos sanguíneos cerebrais é importante para o diagnóstico, tratamento e prognóstico. No entanto, as abordagens atuais para estudar os componentes celulares dos coágulos são baseadas principalmente na coloração in situ , o que é inadequado para o estudo abrangente dos componentes celulares porque as células estão firmemente envolvidas nos coágulos. Estudos anteriores conseguiram isolar uma enzima fibrinolítica (FEs) de Sipunculus nudus, que pode degradar diretamente a fibrina reticulada, liberando os componentes celulares. Este estudo estabeleceu um método abrangente baseado na FEF para estudar os componentes celulares do trombo cerebral. Esse protocolo inclui dissolução de coágulos, liberação de células, coloração de células e exame de sangue de rotina. De acordo com esse método, os componentes celulares puderam ser estudados quantitativa e qualitativamente. Os resultados representativos dos experimentos que utilizam este método são mostrados.
Introduction
A doença cerebrovascular é uma das três principais doenças que podem ameaçar a saúde humana, dentre as quais a doença cerebrovascular isquêmica é responsável por mais de 80%. A trombose cerebral e a trombose venosa cerebral são as doenças isquêmicas cerebrovasculares mais afetadas na atualidade, causadas principalmente por coágulos sanguíneoscerebrais1,2. Se o tratamento não for feito adequadamente, terá altas taxas de incapacidade e mortalidade e alta taxa de recorrência após a altahospitalar3.
Recentemente, um número crescente de estudos tem demonstrado que os componentes celulares dos coágulos sanguíneos cerebrais estão estreitamente correlacionados com o diagnóstico, tratamento e prognóstico da trombosecerebral4,5,6. Portanto, a disponibilidade de dados sobre a composição do trombo, especialmente os componentes celulares, é importante para o diagnóstico clínico e tratamento. Infelizmente, os métodos atualmente disponíveis não podem analisar quantitativa e qualitativamente o componente do coágulo sanguíneo. Por exemplo, a coloração in situ baseada em Martius Scarlett Blue só pode estudar os glóbulos vermelhos/brancos de certas fatias do coágulo7. A coloração in situ baseada em imuno-histoquímica (IHQ) só pode estudar componentes sanguíneos limitados de certos cortes do coágulo usando seus anticorpos8. Os métodos microscópicos baseados em imagens preocupam-se apenas com a estrutura específica do coágulo9. Além disso, todos esses métodos são trabalhosos e demorados10. Até o momento, os procedimentos para estudo quantitativo e qualitativo dos componentes das células dos trombos cerebrais não foram relatados. É amplamente reconhecido que a fibrina reticulada envolve firmemente as células sanguíneas nos coágulos11. Consequentemente, a degradação específica da fibrina reticulada e a liberação das células intactas são críticas para a análise precisa dos componentes celulares.
Trabalhos anteriores isolaram uma enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE), que pode degradar a fibrina específica e rapidamente12. Neste trabalho, foi proposto um método para analisar os componentes celulares dos trombos cerebrais baseado na atividade única da FEs. Esse protocolo utilizou o FE para degradar primeiramente a fibrina dos coágulos e, em seguida, analisou os componentes celulares pela coloração de Wright e exame de sangue de rotina13,14. De acordo com esse método, os componentes celulares dos trombos cerebrais podem ser estudados quantitativa e qualitativamente. Este protocolo simples e eficaz pode ser aplicado para a análise de componentes celulares de outros coágulos sanguíneos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O FEs é um agente fibrinolítico capaz de degradar a fibrina de forma direta e eficaz12,16. Aqui, o sFE foi empregado para degradar a fibrina reticulada dos coágulos sanguíneos cerebrais, liberar as células fechadas dentro dos coágulos e analisar qualitativa e quantitativamente os componentes celulares dos coágulos. Os dados de microscopia e o exame de sangue de rotina indicaram que as células fechadas foram liberadas dos coágulos sanguíneos. Além disso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Cidade de Xiamen (3502Z20227197) e pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
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