Summary

Un approccio completo per analizzare i componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Questo studio descrive un metodo rapido ed efficace per l’analisi dei componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale attraverso la dissoluzione del coagulo, la colorazione cellulare e l’esame del sangue di routine.

Abstract

La trombosi cerebrale, un coagulo di sangue in un’arteria o vena cerebrale, è il tipo più comune di infarto cerebrale. Lo studio dei componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale è importante per la diagnosi, il trattamento e la prognosi. Tuttavia, gli attuali approcci allo studio dei componenti cellulari dei coaguli si basano principalmente sulla colorazione in situ , che non è adatta per lo studio completo dei componenti cellulari perché le cellule sono strettamente avvolte nei coaguli. Studi precedenti hanno isolato con successo un enzima fibrinolitico (sFE) da Sipunculus nudus, che può degradare direttamente la fibrina reticolata, rilasciando i componenti cellulari. Questo studio ha stabilito un metodo completo basato sull’sFE per studiare i componenti cellulari del trombo cerebrale. Questo protocollo include la dissoluzione del coagulo, il rilascio cellulare, la colorazione cellulare e l’esame del sangue di routine. Secondo questo metodo, i componenti cellulari potrebbero essere studiati quantitativamente e qualitativamente. Vengono mostrati i risultati rappresentativi degli esperimenti che utilizzano questo metodo.

Introduction

La malattia cerebrovascolare è una delle tre principali malattie che possono minacciare la salute umana, tra le quali la malattia cerebrovascolare ischemica rappresenta oltre l’80%. La trombosi cerebrale e la trombosi venosa cerebrale sono oggi le malattie cerebrovascolari ischemiche più preoccupanti, causate principalmente da coaguli di sangue cerebrale 1,2. Se il trattamento non viene eseguito correttamente, avrà alti tassi di disabilità e mortalità e un alto tasso di recidiva dopo la dimissione3.

Recentemente, un numero crescente di studi ha dimostrato che i componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale sono strettamente correlati con la diagnosi, il trattamento e la prognosi della trombosi cerebrale 4,5,6. Pertanto, la disponibilità di dati sulla composizione del trombo, in particolare sui componenti cellulari, è importante per la diagnosi clinica e il trattamento. Sfortunatamente, i metodi attualmente disponibili non sono in grado di analizzare in modo completo la componente del coagulo di sangue quantitativamente e qualitativamente. Ad esempio, la colorazione in situ a base di Martius Scarlett Blue può studiare solo i globuli rossi/bianchi di alcune fette del coagulo7. La colorazione in situ basata sull’immunoistochimica (IHC) può studiare solo i componenti limitati del sangue di alcune fette del coagulo utilizzando i loro anticorpi8. I metodi basati su immagini microscopiche riguardano solo la struttura specifica del coagulo9. Inoltre, tutti questi metodi sono laboriosi e richiedono molto tempo10. Ad oggi, le procedure per lo studio quantitativo e qualitativo dei componenti delle cellule trombiformi cerebrali non sono state riportate. È ampiamente riconosciuto che la fibrina reticolata avvolge strettamente le cellule del sangue nei coaguli11. Di conseguenza, la degradazione specifica della fibrina reticolata e il rilascio delle cellule intatte sono fondamentali per l’analisi accurata dei componenti cellulari.

Lavori precedenti hanno isolato un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus (sFE), che può degradare la fibrina in modo specifico e rapido12. In questo caso, è stato proposto un metodo per analizzare i componenti cellulari dei trombi cerebrali basato sull’attività unica di sFE. Questo protocollo ha utilizzato sFE per degradare prima la fibrina dei coaguli e poi ha analizzato i componenti cellulari mediante colorazione di Wright ed esame del sanguedi routine 13,14. Secondo questo metodo, i componenti cellulari dei trombi cerebrali possono essere studiati quantitativamente e qualitativamente. Questo protocollo semplice ed efficace potrebbe essere applicato per l’analisi della componente cellulare di altri coaguli di sangue.

Protocol

La ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida istituzionali del Comitato di Etica Medica dell’Università di Huaqiao. I coaguli di sangue cerebrale sono stati rimossi chirurgicamente e raccolti presso il Quanzhou First Hospital, affiliato alla Fujian Medical University, con il consenso informato dei pazienti. 1. Pretrattamento del coagulo di sangue Disporre i coaguli su un piatto pulito, aggiungere 5 ml di soluzione fisiologica con una pinzetta, agit…

Representative Results

Nella fase iniziale del processo di degradazione, è stato riscontrato che i coaguli di sangue avevano una struttura compatta rossa e la soluzione di lavoro era incolore. Dopo un’incubazione di 30 minuti, la soluzione di lavoro è diventata di colore rosso chiaro, il che indica che le cellule del sangue incrociate sono state rilasciate nella soluzione di lavoro. La maggior parte dei coaguli si è dissolta quando si è allungato il tempo di incubazione a 5 ore e la soluzione di lavoro è diventata rosso chiaro. Al contrar…

Discussion

sFE è un agente fibrinolitico in grado di degradare la fibrina direttamente ed efficacemente12,16. Qui, sFE è stato impiegato per degradare la fibrina reticolata dei coaguli di sangue cerebrale, rilasciare le cellule racchiuse all’interno dei coaguli e analizzare qualitativamente e quantitativamente i componenti cellulari dei coaguli. I dati della microscopia e l’esame del sangue di routine hanno indicato che le cellule racchiuse sono state rilasciate dai coagu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata finanziata dall’Ufficio per la scienza e la tecnologia della città di Xiamen (3502Z20227197) e dall’Ufficio per la scienza e la tecnologia della provincia del Fujian (n. 2019J01070, n. 2021Y0027).

Materials

Agglutination Reaction Plate ROTEST RTB-4003
Auto Hematology Analyzer SYSMEX XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer  SANYO MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL) Biosharp BS-15-M
Clean bench AIRTECH BLB-1600
Constant Temperature Incubator JINGHONG JHS-400
Culture Dish (100 mm) NEST 704001
DHG Series Heating and Drying Oven  SENXIN DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance DENVER TP-213
Filter Membrane (0.22 µm) Millex GP SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge  Cence H1650-W
Microscope Slides CITOGLAS 01-30253-50
Milli-Q Reference Millipore Z00QSV0CN
Normal Saline CISEN H37022337
Optical Microscope Nikon ECLIPSE E100
Parafilm Bemis PM-996
Phosphate-Buffered Saline Beyotime C0221A
Pipette Tip (1 mL ) Axygene T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL) Axygene T-200XT-C
Pipettor (1 mL) Thermo Fisher Scientific ZY18723
Pipettor (200 µL) Thermo Fisher Scientific ZY20280
Scalpel MARTOR 23111
Small-sized Vortex Oscillator Kylin-Bell VORTEX KB3
Tweezer Hystic HKQS-180
Wright Staining Solution Beyotime C0135-500ml

References

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Cite This Article
Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots. J. Vis. Exp. (197), e65791, doi:10.3791/65791 (2023).

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