Summary

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Published: December 16, 2022
doi:

Summary

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1’i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Abstract

T hücresi reseptör stimülasyonuna yanıt olarak kalsiyum akışı, T hücresi sinyallemesinin yaygın bir ölçüsüdür. Kalsiyum sinyalizasyonunu bant geçişli akış sitometrisi ile değerlendirmek için çeşitli kalsiyum indikatör boyaları geliştirilmiştir. Bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak birincil murin T-hücrelerindeki kalsiyum yanıtlarını ölçmek için tasarlanmıştır. Toplam splenositler, orantısal kalsiyum indikatör boyası Indo-1 ve hücre yüzey moleküllerine florokrom konjuge antikorlardan oluşan bir panel ile etiketlenir. Tam spektrumlu akış sitometrisinin yeteneklerinden yararlanmak, Hint-1 ile kombinasyon halinde çok çeşitli hücre yüzeyi lekelerini kullanmak için bir platform sağlar. Hücreler daha sonra T hücresi reseptörünü uyarmak için bir anti-CD3 antikorunun eklenmesinden önce ve sonra 37 ° C’de gerçek zamanlı olarak analiz edilir. Spektral sinyallerin karıştırılmasından sonra, kalsiyuma bağlı kalsiyumun kalsiyumsuz Hint-1’e oranı hesaplanır ve her kapılı splenosit popülasyonu için zaman içinde görselleştirilebilir. Bu teknik, çoklu hücre popülasyonlarında kalsiyum yanıtlarının eşzamanlı analizine izin verebilir.

Introduction

T-hücresi reseptörü (TCR) ile indüklenen kalsiyum akışı, T-hücresi aktivasyonunun yararlı bir ölçüsüdür ve sıklıkla bir T-hücresi popülasyonunun TCR sinyal yolu1’in proksimal adımlarında bozulmuş yanıtlara sahip olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Kalsiyum akışının ölçümleri genellikle T hücrelerinin bir veya bir çift floresan kalsiyum gösterge boyası ile önceden etiketlenmesi ve daha sonra TCR çapraz bağlama 2,3,4’ten sonra gerçek zamanlı olarak akış sitometrisi kullanılarak floresan sinyallerinin incelenmesiyle gerçekleştirilir. Orantı-metrik bir kalsiyum boyası olan Indo-1, kalsiyum bağlanma5’e bağlı iki farklı dalga boyunda pik emisyonlara sahip UV lazer tarafından uyarılır ve canlı lenfositlerde kalsiyum yanıtlarının akış sitometri analizi için yaygın olarak kullanılan bir gösterge boyasıdır. Hint-1’in emisyon profili oldukça geniş olduğundan, Hint-1 değerlendirmesini bant geçişli akış sitometrisi ile çoklu hücre yüzey belirteçlerinin eşzamanlı analizi ile birleştirmek zor olabilir. Bu sınırlama, önceden saflaştırılmış T hücresi popülasyonlarına veya sınırlı sayıda hücre yüzey molekülü tarafından tanımlanan popülasyonlara kalsiyum yanıtlarının akış sitometri analizinin kullanımını kısıtlar.

Primer lenfositlerin heterojen popülasyonları üzerindeki kalsiyum yanıtlarının bant geçişli akış sitometrisi kullanılarak ölçülmesinin sınırlamalarını ele almak için, tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak Hint-1 floresansını ölçmek için bir protokol geliştirilmiştir. Bu yöntem, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanarak, Hint-1’in hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoğullanmasına izin verir. Tam spektrumlu akış sitometrisinin geleneksel akış sitometrisine göre avantajı, floresan sinyallerini yüksek oranda örtüşen boyalardan ayırt etme kabiliyeti ve böylece her numunede aynı anda değerlendirilebilen yüzey belirteçlerinin sayısını arttırmasıdır. Geleneksel akış sitometrisi bandpass filtreleri kullanır ve dedektör sistemi6 başına bir florokrom ile sınırlıdır. Tam spektrumlu akış sitometrisi, beş lazerli spektral akış sitometri sistemi 7,8 üzerinde 64 dedektör kullanarak florokromun tüm spektrumu boyunca sinyaller toplar. Ek olarak, tam spektrumlu akış sitometrisi, geleneksel akış sitometrelerinde bulunan fotoçarpan tüp dedektörlerine göre artan duyarlılığa sahip APD (Çığ Fotoğraf Diyot) dedektörlerinden yararlanır8. Sonuç olarak, bu yaklaşım, kalsiyum boya etiketlemesinden önce spesifik T hücresi popülasyonlarının izolasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırdığından, periferik kan mononükleer hücreleri veya murin sekonder lenfoid organ hücresi süspansiyonları gibi heterojen hücre popülasyonları için idealdir. Bunun yerine, veri toplandıktan sonra hücre yüzey belirteci ekspresyon profilleri ve akış sitometrisi geçişi, ilgilenilen her popülasyondaki kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu raporda gösterildiği gibi, Hint-1, sekiz florokrom konjuge antikorla kolayca birleştirilebilir ve bu da toplam 10 benzersiz spektral imza ile sonuçlanır. Ayrıca, bu yöntem konjenik olarak farklı fare çizgilerinden gelen hücre karışımlarına kolayca uygulanabilir ve bu da gen hedefli bir fare hattından gelenlere kıyasla vahşi tip T hücrelerindeki kalsiyum tepkilerinin eşzamanlı analizine izin verir.

Protocol

Fareler, IACUC protokollerine uygun olarak Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp kampüsünde tutuldu. Tüm fareler AAALAC standartlarına göre ötenazi yapıldı. 1. Fare dalağından bağışıklık hücrelerinin hazırlanması NOT: CO2 ötenazi ile naif fareleri ötenazi yapın. Jackson Laboratuvarları’ndan satın alınan ve şirket içinde yetiştirilen C57BL/6 fareleri, 6-12 haftalıkken deneyler için kullanılır. Deneyler için hem…

Representative Results

Çoklu yüzey lekelerine sahip bir Hint-1 oranmetrik boya kullanarak birincil murin T-hücrelerinde kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için deneysel iş akışı Şekil 1’de gösterilmiştir. Fare splenositlerini tek bir hücre süspansiyonuna topladıktan ve işledikten sonra, hücreler bir Hint-1 esteri ile boyanır ve yüzey florokroma bağlı antikorlarla boyanır. Boya yüklemesi ve antikor boyama işlemi tamamlandıktan sonra, lenfosit örnekleri biyolojik bir sıcaklığa (37 °…

Discussion

Bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisi 7,8 kullanarak titre edilmiş Hint-1 oranmetrik indikatör boyası ile yüklenen primer murin T-hücrelerinde kalsiyum yanıtlarını ölçmek için tasarlanmış optimize edilmiş bir tahlili açıklamaktadır. Tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak kalsiyum akısı testleri yapmanın avantajı, Indo-1 floresansının değerlendirilmesi ile birlikte yüzey hücresi belirteci boyamasını çoklama yeteneğidir….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R01AI132419, CU | AMC İmmünomikro Akış Sitometrisi Paylaşılan Kaynak, RRID: SCR_021321, Aurora ve SpectroFlo yazılımı üzerinde tam spektral sitometrik analizin sürekli tartışmaları için Cytek’teki meslektaşlarımıza çok teşekkür ederiz. Figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

References

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022)
  14. SpctroFlo Software. Cytek Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022)
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022)
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

Play Video

Cite This Article
Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

View Video