Analyse des T-Zellrezeptor-induzierten Kalziumeinstroms in primäre murine T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie

Der durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) induzierte Kalziumeinstrom ist ein nützliches Maß für die T-Zell-Aktivierung und wird häufig verwendet, um festzustellen, ob eine Population von T-Zellen eine beeinträchtigte Reaktion in den proximalen Schritten des TCR-Signalwegs^{aufweist 1}. Messungen des Kalziumeinstroms werden in der Regel durchgeführt, indem die T-Zellen mit einem oder zwei fluoreszierenden Kalziumindikatorfarbstoffen vormarkiert und dann die Fluoreszenzsignale mittels Durchflusszytometrie in Echtzeit nach TCR-Vernetzung untersucht^werden 2,3,4. Indo-1, ein ratiometrischer Calciumfarbstoff, wird durch den UV-Laser mit Spitzenemissionen bei zwei verschiedenen Wellenlängen angeregt, die von der Calciumbindung⁵ abhängen, und ist ein häufig verwendeter Indikatorfarbstoff für die durchflusszytometrische Analyse von Calciumantworten in lebenden Lymphozyten. Da das Emissionsprofil von Indo-1 recht breit gefächert ist, kann es schwierig sein, die Indo-1-Bewertung mit der gleichzeitigen Analyse mehrerer Zelloberflächenmarker mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu kombinieren. Diese Einschränkung schränkt die Verwendung der durchflusszytometrischen Analyse von Kalziumantworten auf vorgereinigte Populationen von T-Zellen oder auf Populationen ein, die durch einen begrenzten Satz von Zelloberflächenmolekülen identifiziert wurden.

Um die Einschränkungen der Messung von Kalziumantworten auf heterogene Populationen primärer Lymphozyten mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu beheben, wurde ein Protokoll zur Messung der Indo-1-Fluoreszenz mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie entwickelt. Diese Methode ermöglicht das Multiplexing von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, und nutzt so die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie. Der Vorteil der Vollspektrum-Durchflusszytometrie gegenüber der konventionellen Durchflusszytometrie besteht darin, dass sie die Fluoreszenzsignale von stark überlappenden Farbstoffen unterscheiden kann, wodurch die Anzahl der Oberflächenmarker erhöht wird, die gleichzeitig in jeder Probe bewertet werden können. Die konventionelle Durchflusszytometrie verwendet Bandpassfilter und ist auf ein Fluorochrom pro Detektorsystem^{beschränkt 6}. Bei der Vollspektrum-Durchflusszytometrie werden Signale über das gesamte Spektrum des Fluorochroms mit 64 Detektoren auf einem spektralen Durchflusszytometriesystem mit fünf Lasern^{erfasst 7,8}. Darüber hinaus nutzt die Vollspektrum-Durchflusszytometrie die Vorteile von APD-Detektoren (Avalanche Photo Diode), die eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu Photomultiplier-Röhrendetektoren aufweisen, die auf herkömmlichen Durchflusszytometern vorhanden sind⁸. Folglich ist dieser Ansatz ideal für die heterogenen Zellpopulationen, wie z.B. mononukleäre Zellen des peripheren Blutes oder sekundäre lymphatische Organzellsuspensionen der Maus, da er die Isolierung spezifischer T-Zellpopulationen vor der Markierung des Kalziumfarbstoffs überflüssig macht. Stattdessen können Expressionsprofile von Zelloberflächenmarkern und durchflusszytometrisches Gating nach der Datenerfassung verwendet werden, um die Kalziumreaktionen in jeder interessierenden Population zu bewerten. Wie in diesem Bericht gezeigt wird, kann Indo-1 problemlos mit acht fluorochrom-konjugierten Antikörpern kombiniert werden, was zu insgesamt 10 einzigartigen spektralen Signaturen führt. Darüber hinaus kann diese Methode leicht auf Mischungen von Zellen aus kongen unterschiedlichen Mauslinien angewendet werden, was die gleichzeitige Analyse der Kalziumantworten in Wildtyp-T-Zellen im Vergleich zu denen einer genspezifischen Mauslinie ermöglicht.