Summary

Análisis de la afluencia de calcio inducida por receptores de células T en células T murinas primarias mediante citometría de flujo de espectro completo

Published: December 16, 2022
doi:

Summary

La afluencia de calcio, una medida de la señalización de las células T, es una forma efectiva de analizar las respuestas a la estimulación del receptor de células T. Este protocolo para multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de superficie celular aprovecha las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo.

Abstract

La afluencia de calcio en respuesta a la estimulación del receptor de células T es una medida común de la señalización de células T. Se han desarrollado varios colorantes indicadores de calcio para evaluar la señalización de calcio mediante citometría de flujo de paso de banda. Este protocolo está diseñado para medir las respuestas de calcio en células T murinas primarias utilizando citometría de flujo de espectro completo. Los esplenocitos totales se marcan con el colorante indicador de calcio ratiométrico Indo-1, junto con un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo contra moléculas de la superficie celular. Aprovechar las capacidades de la citometría de flujo de espectro completo proporciona una plataforma para utilizar una amplia gama de tinciones de superficie celular en combinación con Indo-1. Las células se analizan en tiempo real a 37 °C antes y después de la adición de un anticuerpo anti-CD3 para estimular el receptor de células T. Después de desmezclar las señales espectrales, se calcula la proporción de Indo-1 unido a calcio libre y se puede visualizar a lo largo del tiempo para cada población cerrada de esplenocitos. Esta técnica puede permitir el análisis simultáneo de las respuestas de calcio en poblaciones celulares múltiples.

Introduction

La afluencia de calcio inducida por receptores de células T (TCR) es una medida útil de la activación de células T y se usa con frecuencia para determinar si una población de células T tiene respuestas deterioradas en los pasos proximales de la vía de señalización TCR1. Las mediciones de la afluencia de calcio generalmente se realizan marcando previamente las células T con uno o un par de colorantes indicadores fluorescentes de calcio, y luego examinando las señales fluorescentes utilizando citometría de flujo en tiempo real después de la reticulación TCR 2,3,4. Indo-1, un colorante de calcio métrico de relación, es excitado por el láser UV con emisiones máximas en dos longitudes de onda diferentes dependiendo de la unión al calcio5, y es un colorante indicador comúnmente utilizado para el análisis de citometría de flujo de las respuestas de calcio en linfocitos vivos. Como el perfil de emisión de Indo-1 es bastante amplio, puede ser difícil combinar la evaluación de Indo-1 con el análisis simultáneo de múltiples marcadores de superficie celular mediante citometría de flujo de paso de banda. Esta limitación restringe la utilización del análisis de citometría de flujo de las respuestas de calcio a poblaciones prepurificadas de células T o a poblaciones identificadas por un conjunto limitado de moléculas de superficie celular.

Para abordar las limitaciones de medir las respuestas de calcio en poblaciones heterogéneas de linfocitos primarios mediante citometría de flujo de paso de banda, se desarrolló un protocolo para medir la fluorescencia Indo-1 mediante citometría de flujo de espectro completo. Este método permite multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de la superficie celular, aprovechando las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo. La ventaja de utilizar la citometría de flujo de espectro completo sobre la citometría de flujo convencional es su capacidad para distinguir las señales fluorescentes de colorantes altamente superpuestos, aumentando así el número de marcadores de superficie que se pueden evaluar simultáneamente en cada muestra. La citometría de flujo convencional utiliza filtros de paso de banda y está restringida a un fluorocromo por sistema detector6. La citometría de flujo de espectro completo recoge señales en todo el espectro del fluorocromo utilizando 64 detectores en un sistema de citometría de flujo espectral de cincoláseres 7,8. Además, la citometría de flujo de espectro completo aprovecha los detectores APD (Avalanche Photo Diode) que tienen una mayor sensibilidad en relación con los detectores de tubos fotomultiplicadores presentes en los citómetros de flujo convencionales8. En consecuencia, este enfoque es ideal para las poblaciones de células heterogéneas, como las células mononucleares de sangre periférica o las suspensiones murinas de células de órganos linfoides secundarios, ya que elimina la necesidad de aislar poblaciones específicas de células T antes del marcado del colorante de calcio. En cambio, los perfiles de expresión del marcador de superficie celular y la activación por citometría de flujo después de la recopilación de datos se pueden usar para evaluar las respuestas al calcio en cada población de interés. Como se muestra en este informe, Indo-1 se puede combinar fácilmente con ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo, lo que resulta en un total de 10 firmas espectrales únicas. Además, este método se puede aplicar fácilmente a mezclas de células de líneas de ratón congénicamente distintas, lo que permite el análisis simultáneo de las respuestas de calcio en células T de tipo salvaje en comparación con las de una línea de ratón dirigida a genes.

Protocol

Los ratones se mantuvieron en el campus médico Anschutz de la Universidad de Colorado de acuerdo con los protocolos de IACUC. Todos los ratones fueron sacrificados de acuerdo con los estándares de AAALAC. 1. Preparación de células inmunes del bazo del ratón NOTA: Eutanasia a ratones ingenuos con eutanasia deCO2 . Los ratones C57BL / 6 comprados en Jackson Laboratories y criados internamente se utilizan para experimentos a las 6-12 sema…

Representative Results

El flujo de trabajo experimental para evaluar las respuestas de calcio en células T murinas primarias utilizando un colorante ratiométrico Indo-1 con tinciones superficiales de multiplexación se muestra en la Figura 1. Después de cosechar y procesar los esplenocitos de ratón en una suspensión de una sola célula, las células se tiñen con un éster Indo-1 AM y se tiñen superficialmente con anticuerpos ligados al fluorocromo. Una vez que se completa la carga de colorante y la tinción…

Discussion

Este protocolo describe un ensayo optimizado diseñado para medir las respuestas de calcio en células T murinas primarias cargadas con colorante indicador ratiométrico Indo-1 titulado utilizando citometría de flujo de espectro completo 7,8. La ventaja de realizar ensayos de flujo de calcio utilizando citometría de flujo de espectro completo es la capacidad de multiplexar la tinción del marcador celular de superficie en combinación con la evaluación de la f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Muchas gracias a nuestros colegas de Cytek por las continuas discusiones sobre el análisis citométrico espectral completo en el software Aurora y SpectroFlo. Las figuras fueron creadas con BioRender.com.

Materials

12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

References

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Cite This Article
Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

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