Summary

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Published: December 28, 2021
doi:

Summary

INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, bu protokolde, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir.

Abstract

Drosophila fototransdüksiyonu, bilinen en hızlı G proteinine bağlı sinyal yollarından biridir. Bu kaskadının özgüllüğünü ve verimliliğini sağlamak için, kalsiyum (Ca2+)-geçirgen katyon kanalı, geçici reseptör potansiyeli (TRP), iskele proteinine sıkıca bağlanır, inaktivasyon-sonrası-potansiyel D (INAD) ve göze özgü protein kinaz C (ePKC) ve fosfolipaz Cβ / No reseptör potansiyeli A (PLCβ / NORPA) ile büyük bir sinyal protein kompleksi oluşturur. Bununla birlikte, Drosophila TRP kanalının biyokimyasal özellikleri belirsizliğini korumaktadır. INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, endojen TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir. İlk olarak, saflaştırılmış histidin (His) etiketli NORPA 863-1095 fragmanı Ni-boncuklara bağlandı ve endojen INAD protein kompleksini Drosophila kafa homojenatlarından aşağı çekmek için yem olarak kullanıldı. Daha sonra, TRP kanalı ile rekabet etmek için Ni-boncuklara aşırı saflaştırılmış glutatyon S-transferaz (GST) etiketli TRP 1261-1275 parçası eklendi. Son olarak, süpernatanttaki TRP kanalı, boyut dışlama kromatografisi ile aşırı TRP 1261-1275 peptidinden ayrıldı. Bu yöntem, Drosophila TRP kanalının geçit mekanizmasını hem biyokimyasal hem de yapısal açılardan incelemeyi mümkün kılar. Saflaştırılmış Drosophila TRP kanallarının elektrofizyoloji özellikleri gelecekte de ölçülebilir.

Introduction

Fototransdüksiyon, emilen fotonların nöronların elektriksel kodlarına dönüştürüldüğü bir süreçtir. Sadece opsinleri ve aşağıdaki G proteinine bağlı sinyal kaskadını hem omurgalılarda hem de omurgasızlarda iletir. Drosophila’da, beş PDZ alanını kullanarak, iskele proteini inaktivasyonu-sonrası-sonrası-potansiyel D (INAD), geçici bir reseptör potansiyeli (TRP) kanalı, fosfolipaz Cβ / No reseptör potansiyeli A (PLCβ / NORPA) ve göze özgü protein kinaz C (ePKC) 1’den oluşan bir supramoleküler sinyal kompleksi düzenler. Bu supramoleküler sinyal kompleksinin oluşumu, Drosophila fototransdüksiyon makinelerinin doğru hücre altı lokalizasyonunu, yüksek verimliliğini ve özgüllüğünü garanti eder. Bu komplekste, ışığa duyarlı TRP kanalları, NORPA’nın aşağı akış efektörleri olarak işlev görür ve kalsiyum akışına ve fotoreseptörlerin depolarizasyonuna aracılık eder. Önceki çalışmalar, Drosophila TRP kanalının açılmasına protonlar, yerel lipit ortamının bozulması veya mekanik kuvvet 2,3,4 aracılık ettiğini göstermiştir. Drosophila TRP kanalı ayrıca kalmodulin5 ile etkileşime girer ve kalsiyum tarafından hem pozitif hem de negatif geri besleme 6,7,8 ile modüle edilir.

Şimdiye kadar, Drosophila TRP ve TRP benzeri (TRPL) kanalların geçit mekanizması üzerine yapılan elektrofizyoloji çalışmaları, eksize edilmiş membran yamalarına, ayrışmış vahşi tip Drosophila fotoreseptörlerinden tüm hücre kayıtlarına ve S2, SF9 veya HEK hücrelerindehetero-eksprese kanallara dayanıyordu. Tam uzunluktaki Drosophila TRP kanalının yapısal bilgileri de belirsizliğini koruyor. Saflaştırılmış proteinin elektrofizyolojik özelliklerini yeniden yapılandırılmış bir membran ortamında incelemek ve tam uzunluktaki Drosophila TRP kanalının yapısal bilgisini elde etmek için, saflaştırılmış tam uzunlukta TRP kanallarının elde edilmesi, memeli TRP kanalı çalışmalarında kullanılan metodolojilere benzer şekilde gerekli ilk adımdır14,15,16,17.

Son zamanlarda, INAD protein kompleksi18,19,20’nin montaj mekanizmasına dayanarak, TRP kanalını streptavidin boncukları5 ile Drosophila kafa homojenatlarından arındırmak için bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir. Streptavidin boncuklarının düşük kapasitesi ve pahalı maliyeti göz önüne alındığında, burada His-etiketli yem proteinini ve buna karşılık gelen düşük maliyetli Ni-boncukları çok daha yüksek kapasiteye sahip kullanan gelişmiş bir saflaştırma protokolü tanıtılmıştır. Önerilen yöntem, TRP kanalının geçit mekanizmasını yapısal açılardan incelemeye ve TRP kanalının elektrofizyolojik özelliklerini saflaştırılmış proteinlerle ölçmeye yardımcı olacaktır.

Protocol

1. GST etiketli TRP ve Onun etiketli NORPA parçalarının saflaştırılması GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını saflaştır CaCl 2 ısı şoku dönüşüm yöntemi 21’i kullanarak pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 plazmid10’u Escherichia coli (E. coli)BL21 (DE3) hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloniye 10 mL Luria Bertani (LB) ortamında aşılayın ve 37 ° C’de gece boyunca büyüyün. Daha sonra, 10 mL tohumlama …

Representative Results

Bu makalede, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için bir protein saflaştırma yöntemi gösterilmiştir (Şekil 1). İlk olarak, yem ve rakip proteinleri elde etmek için rekombinant protein ekspresyonu ve saflaştırma uygulanır. Daha sonra, GST etiketli bir TRP 1261-1275 fragmanı, LB ortamındaki E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde eksprese edilir ve glutatyon boncukları ve bir boyut hariç tutma sütunu kullanılarak saflaştı…

Discussion

Beş PDZ alanı içeren INAD, Drosophila fototransdüksiyon makinelerinin temel organizatörüdür. Önceki çalışmalar, INAD PDZ3’ün TRP kanalı C-terminal kuyruğuna zarif bir özgüllükle bağlandığını göstermiştir (KD = 0.3 μM)18. INAD PDZ45 tandem, NORPA 863-1095 fragmanı ile son derece yüksek bir bağlanma afinitesi ile etkileşime girer (KD = 30 nM). Bu bulgular, NORPA CC-PBM parçasının aşağı çekme yemi olarak kullanılmasını sağlayan af…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31870746), Shenzhen Temel Araştırma Hibeleri (JCYJ20200109140414636) ve Guangdong Eyaleti, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2021A1515010796) tarafından W. L. L. tarafından desteklenmiştir. LetPub’a (www.letpub.com) bu makalenin hazırlanması sırasındaki dilbilimsel yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain Bloomington Drosophila Stock Center BDSC:3605 Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves Jiufeng metal mesh company GB/T6003.1 Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) Lablead A3291 SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate Invitrogen HC2005 SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor Roche 05892953001 Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250 Sangon Biotech A100472-0025 SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT) Sangon Biotech A620058-0100 Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) Sangon Biotech A500838-0500 Size-exclusion column buffer preparation
Glycine Sangon Biotech A610235-0005 SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads Cytiva 17513202 Affinity chromatography
Imidazole Sangon Biotech A500529-0001 Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sangon Biotech A600168-0025 Induction of protein overexpression
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002-0250 E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma-aldrich G4251-100G Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads Cytiva 17371202 Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) Sangon Biotech A610424-001 Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-aldrich T9281-100ML SDS-PAGE gel preparation
PBS Sangon Biotech E607008-0500 Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF Lablead P0754-25G Protease inhibitor
Prestained protein marker Thermo Scientific 26619/26616 Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade) Cytiva 28989336 HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade) Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride Sangon Biotech A501218-0001 Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sangon Biotech A500228-0001 SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base Sigma-aldrich T1503-10KG Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column Millipore UFC901096/801096 Protein concentration
Equipment
Analytical Balance DENVER APX-60 Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes Eppendorf 5810R Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes Eppendorf 5417R Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) Bio-Rad 738-0015 TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) Bio-Rad 738-0017 Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System Bio-Rad Universal Hood II Gel Doc XR System SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge Beckman coulter Avanti J-26 XP Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer UNION-BIOTECH UH-05 Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank Taylor-Wharton CX-100 Drosophila head preparation
Protein purification system Cytiva AKTA purifier Protein purification
Refrigerator (-80°C) Thermo 900GP Drosophila head preparation
Spectrophotometer MAPADA UV-1200 OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000c Determination of protein concentration
Ultracentrifuge Beckman coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge Ultracentrifugation

References

  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. 神经科学. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Play Video

Cite This Article
Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels. J. Vis. Exp. (178), e63260, doi:10.3791/63260 (2021).

View Video