Summary

Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen

Published: December 28, 2021
doi:

Summary

Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde in diesem Protokoll eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen Drosophila TRP-Kanal zu reinigen.

Abstract

Die Drosophila-Phototransduktion ist einer der schnellsten bekannten G-Protein-gekoppelten Signalwege. Um die Spezifität und Effizienz dieser Kaskade zu gewährleisten, bindet der Calcium (Ca2+)-permeable Kationenkanal, das transiente Rezeptorpotential (TRP), fest an das Gerüstprotein Inactivation-No-after-potential D (INAD) und bildet einen großen Signalproteinkomplex mit augenspezifischer Proteinkinase C (ePKC) und Phospholipase Cβ/No Rezeptorpotential A (PLCβ/NORPA). Die biochemischen Eigenschaften des Drosophila TRP-Kanals bleiben jedoch unklar. Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen TRP-Kanal zu reinigen. Zuerst wurde das gereinigte Histidin (His)-markierte NORPA 863-1095-Fragment an Ni-Perlen gebunden und als Köder verwendet, um den endogenen INAD-Proteinkomplex aus Drosophila-Kopfhomogenaten abzuziehen. Dann wurde den Ni-Perlen ein übermäßig gereinigtes Glutathion-S-Transferase (GST)-markiertes TRP 1261-1275-Fragment hinzugefügt, um mit dem TRP-Kanal zu konkurrieren. Schließlich wurde der TRP-Kanal im Überstand durch Größenausschlusschromatographie vom übermäßigen TRP 1261-1275-Peptid getrennt. Diese Methode ermöglicht es, den Gating-Mechanismus des Drosophila TRP-Kanals sowohl aus biochemischer als auch aus struktureller Sicht zu untersuchen. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigten Drosophila TRP-Kanälen können auch in Zukunft gemessen werden.

Introduction

Phototransduktion ist ein Prozess, bei dem absorbierte Photonen in elektrische Codes von Neuronen umgewandelt werden. Es leitet ausschließlich Opsine und die folgende G-Protein-gekoppelte Signalkaskade sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen weiter. In Drosophila organisiert das Gerüstprotein Inactivation-No-after-potential D (INAD) unter Verwendung seiner fünf PDZ-Domänen einen supramolekularen Signalkomplex, der aus einem transienten Rezeptorpotential (TRP)-Kanal, Phospholipase Cβ/No-Rezeptorpotential A (PLCβ/NORPA) und einer augenspezifischen Proteinkinase C (ePKC)1 besteht. Die Bildung dieses supramolekularen Signalkomplexes garantiert die korrekte subzelluläre Lokalisation, hohe Effizienz und Spezifität der Drosophila-Phototransduktionsmaschinerie. In diesem komplexen Komplex wirken lichtempfindliche TRP-Kanäle als nachgeschaltete Effektoren von NORPA und vermitteln den Kalziumeinstrom und die Depolarisation von Photorezeptoren. Frühere Studien zeigten, dass die Öffnung des Drosophila TRP-Kanals durch Protonen, Störung der lokalen Lipidumgebung oder mechanische Kraft 2,3,4 vermittelt wird. Der Drosophila TRP-Kanal interagiert auch mit Calmodulin5 und wird durch Calcium sowohl durch positive als auch durch negative Rückkopplung 6,7,8 moduliert.

Bisher basierten elektrophysiologische Studien über den Gating-Mechanismus von Drosophila TRP und TRP-ähnlichen (TRPL) Kanälen auf ausgeschnittenen Membranpflastern, Ganzzellaufzeichnungen von dissoziierten Wildtyp-Drosophila-Photorezeptoren und heteroexprimierten Kanälen in S2-, SF9- oder HEK-Zellen 2,9,10,11,12,13, aber nicht auf gereinigten Kanälen. Die Strukturinformationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge bleiben ebenfalls unklar. Um die elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigtem Protein in einer rekonstituierten Membranumgebung zu untersuchen und strukturelle Informationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge zu gewinnen, ist die Gewinnung gereinigter TRP-Kanäle in voller Länge der notwendige erste Schritt, ähnlich den Methoden, die in den TRP-Kanalstudien von Säugetieren verwendet werden 14,15,16,17.

Kürzlich wurde auf der Grundlage des Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes18,19,20 erstmals eine Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den TRP-Kanal von Drosophila-Kopfhomogenaten durch Streptavidin-Perlen5 zu reinigen. In Anbetracht der geringen Kapazität und der teuren Kosten von Streptavidin-Perlen wird hier ein verbessertes Reinigungsprotokoll eingeführt, das His-getaggtes Köderprotein und entsprechende kostengünstige Ni-Perlen mit viel höherer Kapazität verwendet. Die vorgeschlagene Methode wird dazu beitragen, den Gating-Mechanismus des TRP-Kanals aus strukturellen Winkeln zu untersuchen und die elektrophysiologischen Eigenschaften des TRP-Kanals mit gereinigten Proteinen zu messen.

Protocol

1. Reinigung von GST-markierten TRP- und His-markierten NORPA-Fragmenten Reinigen Sie das TRP 1261-1275-Fragment mit GST-Tag Wandeln Sie das pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 Plasmid 10 in Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) Zellen mit der CaCl2 Hitzeschock-Transformationsmethode21 um. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie in 10 ml Luria Bertani (LB) Medium und wachsen Sie über Nacht bei 37 ° C. Dann verstärken Sie die 10 ml A…

Representative Results

In diesem Artikel wird eine Proteinreinigungsmethode zur Reinigung des endogenen Drosophila-TRP-Kanals demonstriert (Abbildung 1). Zuerst werden rekombinante Proteinexpression und -reinigung angewendet, um die Köder- und Konkurrenzproteine zu erhalten. Dann wird ein GST-markiertes TRP 1261-1275-Fragment in E. coli BL21 (DE3)-Zellen in LB-Medium exprimiert und mit Glutathionkügelchen und einer Größenausschlusssäule gereinigt (<strong class="x…

Discussion

INAD, das fünf PDZ-Domänen enthält, ist der Hauptorganisator der Drosophila-Fototransduktionsmaschinerie. Frühere Studien zeigten, dass INAD PDZ3 mit exquisiter Spezifität (KD = 0,3 μM) an den TRP-Kanal C-Terminal Tail bindet18. Das INAD PDZ45 Tandem interagiert mit NORPA 863-1095 Fragment mit extrem hoher Bindungsaffinität (KD = 30 nM). Diese Ergebnisse liefern eine solide biochemische Grundlage für die Entwicklung der Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbss…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) und der Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (Nr. 2021A1515010796) an W. L. unterstützt. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für die sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

Materials

Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain Bloomington Drosophila Stock Center BDSC:3605 Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves Jiufeng metal mesh company GB/T6003.1 Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) Lablead A3291 SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate Invitrogen HC2005 SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor Roche 05892953001 Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250 Sangon Biotech A100472-0025 SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT) Sangon Biotech A620058-0100 Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) Sangon Biotech A500838-0500 Size-exclusion column buffer preparation
Glycine Sangon Biotech A610235-0005 SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads Cytiva 17513202 Affinity chromatography
Imidazole Sangon Biotech A500529-0001 Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sangon Biotech A600168-0025 Induction of protein overexpression
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002-0250 E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma-aldrich G4251-100G Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads Cytiva 17371202 Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) Sangon Biotech A610424-001 Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-aldrich T9281-100ML SDS-PAGE gel preparation
PBS Sangon Biotech E607008-0500 Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF Lablead P0754-25G Protease inhibitor
Prestained protein marker Thermo Scientific 26619/26616 Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade) Cytiva 28989336 HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade) Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride Sangon Biotech A501218-0001 Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sangon Biotech A500228-0001 SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base Sigma-aldrich T1503-10KG Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column Millipore UFC901096/801096 Protein concentration
Equipment
Analytical Balance DENVER APX-60 Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes Eppendorf 5810R Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes Eppendorf 5417R Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) Bio-Rad 738-0015 TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) Bio-Rad 738-0017 Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System Bio-Rad Universal Hood II Gel Doc XR System SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge Beckman coulter Avanti J-26 XP Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer UNION-BIOTECH UH-05 Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank Taylor-Wharton CX-100 Drosophila head preparation
Protein purification system Cytiva AKTA purifier Protein purification
Refrigerator (-80°C) Thermo 900GP Drosophila head preparation
Spectrophotometer MAPADA UV-1200 OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000c Determination of protein concentration
Ultracentrifuge Beckman coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge Ultracentrifugation

References

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Cite This Article
Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels. J. Vis. Exp. (178), e63260, doi:10.3791/63260 (2021).

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